中枢神经系统血管母细胞瘤细胞与人脑神经元细胞差异蛋白质分析

　　　　 作者：刘杭 谢嵘 姚鋆 樊惠芝 朱剑虹 杨芃原

【摘要】 以人工培养的中枢神经系统血管母细胞瘤(Central nervous system hemangioblastoma，HB)细胞为研究对象，发展了蛋白质组学分析方法，鉴定了HB细胞与人脑神经元细胞的差异蛋白质。采用在线HPLC串联LTQOrbitrap质谱鉴定样品的可溶性蛋白质，得到了HB细胞的蛋白质组表达谱。HB细胞鉴定得到674个蛋白质，神经元细胞鉴定获得531个蛋白质。根据基于肽段鉴定的蛋白质组半定量分析方法对质谱数据进行蛋白质的差异比较分析，发现了波形蛋白(Vimentin)，1433 epsilon蛋白和碳酸酐酶Ⅱ(Carbonic anhydrase Ⅱ，CA Ⅱ)等在HB细胞中表达量发生明显变化的蛋白质，并对其进行了免疫组织化学染色分析。结果显示，波形蛋白(Vimentin)、1433 epsilon蛋白以及碳酸酐酶Ⅱ(CA Ⅱ)等蛋白质表达量的改变与HB的发病密切相关，对探索HB的起源有重要意义。

【关键词】 中枢神经系统血管母细胞瘤， 蛋白质组学， 高效液相色谱质谱， 半定量分析

　　 1 引 言

　　蛋白质表达量变化信息是蛋白质组研究的重要内容之一。与稳定同位素标记定量法[1]相比，无标记的蛋白质半定量方法是一种为了弥补单纯依靠质谱信号强度定量的不足而提出的定量方法。本方法结合了传统色谱法的以色谱峰面积为基础的定量方法，以肽段鉴定为基础进行色谱峰的选取。其优点在于：具有较好的重现性和线性范围;无需额外操作(如同位素标记)，定量步骤全部由计算机完成;可以灵活选择加入已知量的已知蛋白质或以样品本身含有的蛋白质为内标[2～6]。

　　中枢神经系统血管母细胞瘤(Central nervous system hemangioblastoma，HB)是常见于小脑的良性肿瘤，其发病机理至今尚未阐明。世界卫生组织在 (http://www.who.int/classifications/icd/)中将其归为来源未定肿瘤。以往对HB的研究多集中在VHL基因上(Von HippelLindau氏病，简称VHL病[7])，并未从蛋白质组角度对其进行过研究。因此，采用蛋白质组学分析技术研究HB，对探讨其致病机理有着重要意义。

　　本研究采用在生物样本实验中广泛采用的HB肿瘤细胞，以二维液相色谱串联LTQOrbitrap质谱技术鉴定HB细胞(简称HB组)和人脑神经元细胞(简称对照组)的可溶性蛋白质组，并利用半定量方法寻找HB组与对照组的差异蛋白质。建立了HB组的高质量精度蛋白质组表达谱，同时将高质量精度质谱应用于寻找HB致病的相关蛋白质，探讨了HB的发病机理。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　JY922D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);UV mini 1240型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);Centrifuge 5417R离心机(德国Eppendorf公司); LTQOrbitrap质谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)， 用2.0sr2 XCalibur软件包中的LTQ Tune控制，XCalibur软件包中的Qualbrowser和Bioworks软件是本实验的数据处理软件。毛细管高效液相色谱系统(荷兰LC Packings公司)，由Famos微量进样器、Switchos微升级液相色谱泵(Switchos泵)和Ultimate纳升级液相色谱泵(Ultimate泵)组成，由Chameleon软件控制。

　　分析过程中共使用3根色谱柱：第一维分析使用强阳离子交换BioSCX柱(柱1，内径1 mm，柱长150 mm，荷兰LCPacking公司);第二维反相分析前使用脱盐/肽段富集柱Captrap柱(柱2，内径0.5 mm，柱长2 mm，美国Michrom Bioresources公司);第二维反相分析使用ZorbaxC18柱(柱3，内径0.3 mm，柱长150 mm，德国Agilent公司)。

　　尿素、碳酸氢铵、甲酸(分析纯，上海迪奥生物科技有限公司);Bradford定量试剂盒(美国BioRad公司);二硫苏糖醇、3[(3胆固醇氨丙基)二甲基氨基]1丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂、乙腈和胰蛋白酶(德国Sigma公司);碘乙酰胺、醋酸铵(分析纯，上海化学试剂有限公司)。超纯水由MilliQ纯水系统(美国Millipore公司)制备。

　　2.2 实验方法

　　细胞培养所用的HB肿瘤组织样本均取自复旦大学附属华山医院神经外科2005年7月～2006年6月收治的HB患者手术切除标本，共收集肿瘤组织13例，其中VHL病6例，非VHL病7例。

　　HB细胞和神经元细胞(各约106个)分别与1 mL细胞裂解液(8 mol/L尿素、4% CHAPS、1 mmol/L PMSF、1 mg/L 亮抑酶肽、1 mg/L胃蛋白酶抑制剂)混合，冰浴中孵育30 min，15000 g×15 min离心(4 ℃)，取上清液1。沉淀加入细胞裂解液100 μL进行超声破碎，15000 g×15 min离心(4 ℃)，取上清液2。合并上清液1和2， 25000 g×30 min离心(4 ℃)，取上清液，-80 ℃保存。蛋白质浓度使用Bradford定量试剂盒测定。

　　2.3 细胞样品酶解

　　取HB组和对照组样品各90 μg，用50 mmol/L NH4HCO3溶液稀释1倍，加入5 μL 10 mmol/L二硫苏糖醇溶液，56 ℃孵育1 h。加5 μL新鲜配制的450 mmol/L碘乙酰胺溶液，室温下避光静置30 min，加入2 μL 1 g/L 胰蛋白酶，34 ℃孵育12 h后，加3 μL 甲酸停止酶解。

　　2.4 二维HPLC串联LTQOrbitrap质谱分析鉴定

　　HPLC仪器全部由Chromeleon软件(Dionex公司)控制。分析系统如图1所示。样品由Switchos泵以60 μL/min的流速经阀1加载到柱1。Switchos泵同时也是将盐溶液加载到柱1上的上样泵。第一维分析用系列盐溶液(0，50，100，200，400，800，1000，2000和2000 mmol/L NH4Ac)依次洗脱样品，洗脱的样品经阀2进入柱2脱去无机盐类。通过阀2的切换开始第二维分析; 第二维反相分析使用的流动相为A相：95%水、5%乙腈、0.1%甲酸;B相：5%水、95%乙腈、0.1%甲酸。梯度为：0～90 min， 5%～50% B; 90～95 min， 含95% B的流动相再生柱3; 95～110 min， 含5% B的流动相平衡柱3。由Ultimate泵以2 μL/min的流速按照梯度在柱3上得到分离后实时送入LTQOrbitrap质谱仪。设置LTQOrbitrap质谱仪扫描质量范围为400～2000 Da(分辨率60000)，将扫描获得的谱图中最强的5个质谱峰进行串级质谱(MS/MS)分析。

　　2.5 数据处理

　　质谱数据通过内嵌于Bioworks软件的Sequest运算程序，使用美国国立生物信息学中心(NCBI)人数据库(2006年12月RefSEQ版本)进行搜索。参数设置为：母离子偏差容忍度50×10-6， 碎片离子偏差容忍度1 Da。考虑半胱氨酸(Cys)甲氧基化(+57 Da)作为固定修饰，甲硫氨酸(Met)氧化(+16 Da)作为可变修饰。在设定蛋白质鉴定取信区间时要求肽段得分Xcorr≥1.9(单电荷)≥2.7(双电荷)≥3.5(多电荷)、ΔCn≥0.1、肽段质量精度不低于10×10-6，并且每个蛋白质至少要求有两条不同的肽段得到鉴定。经过验证，假阳性率为1%。

　　2.6 半定量分析

　　在进样的蛋白质总量相同的条件下，以得到的每一个蛋白质的所有得到鉴定的肽段的色谱峰积分面积之和作为蛋白质自身的“峰强度”In，计算出每一个蛋白质在样品中的相对丰度(In%，即蛋白质的峰强度占样品所有峰强度和的百分比)，然后以细胞骨架蛋白Beta肌动蛋白为内标，将样品中Beta肌动蛋白百分比进行归一化校正，以其它蛋白质在两组样品的百分比的比值作为半定量的依据。

　　具体方法为：(1)选取/提取合适量的两组样品;(2)选择内标，该内标要求在两组样品中皆稳定存在，异构体少并且在样品中的含量不发生变化或变化极少。本实验选用Beta肌动蛋白作内标;(3)样品酶解后的肽段采用色谱质谱联用仪鉴定;(4)计算每个得到鉴定的蛋白质的肽段的色谱峰面积， 利用内标对蛋白质的色谱峰面积进行归一化;(5)比较两组样品中得到鉴定的蛋白质的归一化后的色谱峰面积作为比较定量的结果;(6)选择1.5倍作为明显差异的阈值。

　　2.7 免疫组化

　　取HB组织和正常脑组织标本同时进行层厚4 μm的常规石蜡切片，使用SABC试剂盒进行免疫组化染色，显微镜下观察，以细胞核和(或)细胞质出现棕黄色染色为阳性。阴性对照以磷酸盐缓冲溶代替一抗，阳性对照参考各产品说明书。

　　3 结果与讨论

　　3.1 半定量分析

　　本研究中，HB组鉴定得到674种蛋白质，对照组鉴定得到531种蛋白质，两组中共有的蛋白质314种。经过半定量分析发现，了波形蛋白(Vimentin)、1433 epsilon蛋白、碳酸酐酶Ⅱ(CA Ⅱ)以及二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(NG，NGdimethylarginine dimethylaminohydrolase， DAAH)等表达量发生了明显变化，暗示了这些蛋白可能和病理密切相关。图2是以HB组和对照组在200 mmol/L NH4Ac下洗出组分为例的半定量流程示意图，用Qualbrowser软件的重叠模式同时打开两次实验文件并且以同一强度标尺显示于同一张图上，在前者为HB组，在后者为对照组。两次实验中，两组均检测出了Vimentin的一条肽段(序列为VERDNLAEDIMR)，在HB组中Xcorr分数为3.20，质量精度为1.9×10-6;在对照组中Xcorr分数为3.66，质量精度为0.6×10-3，均符合鉴定的统计性显著性标准。因此提取该肽段的色谱信号做提取离子流(XIC)，即图2B。将鉴定到的Vimentin肽段的XIC图的曲线积分面积之和对Beta Actin归一化后即作为Vimentin的比较定量依据。

　　图2 半定量示意图(A)HB组(前)和对照组(后)的在200 mmol/L NH4Ac洗出组分的色谱总离子流(基峰)图; (B)Vimentin肽段(序列VEVERDNLAEDIMR)在HB组(前)和对照组(后)提取离子流图将HB组与对照组的积分面积值相除即得到HB组与对照组蛋白质的相对含量值。选取比率HB/con≥1.5倍和con/HB≤-1.5倍的蛋白，共得到64个差异蛋白质。在这些蛋白质中，Vimentin蛋白表达上调4.5倍，而1433 epsilon蛋白以及CA Ⅱ则仅在对照组中检测到，与本研究组进行的HB肿瘤组织的蛋白质组研究有所不同[8]。

　　对前3种蛋白进行了免疫组化分析。免疫组化染色结果显示，Vimentin，1433 epsilon蛋白和CA Ⅱ在HB组织中的基质细胞及内皮细胞均呈阳性表达，而在正常人脑组织中呈阴性表达。

　　3.2 相关差异蛋白质

　　3.2.1 Vimentin Vimentin是间充质细胞的主要中间丝蛋白。中间丝是真核丝生物细胞的重要结构性特征，与微管及肌动蛋白微细丝组成细胞骨架。Vimentin分布于间充质来源的许多细胞，如成纤维细胞、内皮细胞及白细胞等，已广泛用于未分化肿瘤以及间叶组织来源肿瘤的鉴别诊断[1]。本研究结果显示波形蛋白在HB组中表达上调(HB/control=4.5)。免疫组化染色发现Vimentin在HB的基质细胞、血管内皮细胞及周细胞中广泛表达(图3)。根据实验结果，可以支持HB是来源于中胚层间质组织的肿瘤以及干细胞起源的说法[11]。

　　图3 差异蛋白质的免疫组化示意图： (A) HB肿瘤组织Vimentin(×400)免疫组化染色(×400);(B)与Vimentin相对照的正常人脑组织(×200)免疫组化染色

　　Fig.3 Immunohistochemistry staining of protein(A) Distinct positive expressions of Vimentin in HB tissue sections(×400). (B)Negative expressions of Vimentin in normal human brain sections(×200)3.2.2 1433 epsilon蛋白 1433 epsilon蛋白参与许多重要的生理及病理过程，如信号转导、细胞生长分化、细胞凋亡及恶性肿瘤形成等[12]。1433 epsilon蛋白的表达常多见于神经系统变性疾病，可能通过抑制细胞凋亡而参与神经系统肿瘤如胶质瘤的发生和发展[13]。Masters等认为阻断1433 epsilon及其受体可能成为治疗该类疾病的有效方法[14]。

　　本研究发现，1433 epsilon蛋白在HB组中表达较对照组低(HB/control=-1.7)，而免疫组化结果显示： 1433 epsilon蛋白在HB肿瘤组织中表达呈阳性，在正常人脑组织中表达为阴性(图4)。根据实验结果，图4 差异蛋白质的免疫组化示意图： (A) HB肿瘤组织1433 epsilon蛋白(× 400) 免疫组化染色; (B) 与1433 epsilon蛋白相对照的正常人脑组织(× 400)免疫组化染色

　　Fig.4 Immunohistochemistry staining of protein(A) 1433 epsilon protein in HB sections(× 400). (B)1433 epsilon protein in normal sections(× 400)结合HB肿瘤在临床上多表现为良性肿瘤的情况，可以推测1433 epsilon蛋白在人脑环境中参与了激活HB细胞，从而导致其向血管内皮细胞、周细胞分化并参与异常血管网的形成。

　　3.2.3 碳酸酐酶Ⅱ(Carbonic anhydrase Ⅱ， CA Ⅱ) 近年来， 许多研究认为CA Ⅱ与肿瘤的侵袭、转移和生物学行为轻度相关[15，16]。有研究认为CA Ⅱ可导致细胞功能紊乱，瘤细胞呈失控性生长，甚至肿瘤细胞的死亡[17，18]。抑制细胞内部的碳酸酐酶分泌(可为细胞核提供重碳酸盐及其它细胞生长必需的元素)，可导致细胞功能紊乱，瘤细胞呈失控性生长，甚至肿瘤细胞的恶性转化。

　　本研究仅在对照组中鉴定到CA Ⅱ，而免疫组显示CA Ⅱ在HB肿瘤组织中呈阳性表达(图5)。据此可认为CA Ⅱ在HB肿瘤组织中呈高表达，可能对HB肿瘤生长产生一定的抑制作用，这可能是导致临床上显示HB肿瘤为偏良性肿瘤的原因之一。而HB细胞培养结果说明HB肿瘤是具有实体细胞的肿瘤，CAⅡ表达的减少或者无表达使得HB细胞得以失控生长，从而导致HB肿瘤的形成。

　　图5 差异蛋白质的免疫组化示意图(A) HB肿瘤组织CA Ⅱ (× 200) 免疫组化染色; (B) 与CA Ⅱ相对照的正常脑组织(× 200)免疫组化染色

　　Fig.5 Immunohistochemistry staining of protein (A) CA Ⅱ in HB sections (× 200). (B)CA Ⅱ in normal sections (× 200)3.2.4 其它重要蛋白质 DAAH是一种催化酶，对体内非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine， ADMA)浓度的控制起至关重要的作用，与血管内皮细胞功能密切相关[19，20]。结合HB的病理学特点以及DAAH的功能，可认为DAAH的缺失在HB的发病过程中起到重要作用，加重了血管内皮细胞的功能障碍，最终导致异常血管网的形成与HB的发病。

　　空泡ATP合成催化酶普通型A亚单位(Vacuolar ATP synthase catalytic(subunit A)， ubiquitous isoform)在HB组中表达下调。该蛋白在ATP的合成中扮演重要角色，其缺失说明HB发病中可能存在ATP代谢异常。ATP合成酶活性降低或缺失会导致细胞内Ca2+浓度升高而使得细胞发生凋亡[21，22]。因此可以推测该蛋白的缺失可能与HB的形成密切相关。

　　ATP合成酶β链线粒体前体(ATP synthase(β chain)，mitochondrial precursor)较对照组下调2.3倍。该蛋白存在于线粒体中，也是一种ATP合成酶，其下调意义与空泡ATP合成催化酶的缺失类似。

　　微管蛋白β4链(Tubulin β4 chain)也是表达下调的蛋白之一。该蛋白是神经元的特异性标志物，在HB极少量表达说明其非神经元细胞起源。

　　4 结 论

　　用液质联用结合无标记定量技术比较分析了HB组和对照组的蛋白质组，建立了HB组的高质量精度蛋白质组表达谱，鉴定了Vimentin，1433 epsilon蛋白以及CA Ⅱ在HB细胞中呈明显变化的蛋白质。这些蛋白表达量的差异可能与HB肿瘤的发生机制有关，而DAAH等蛋白质的缺失也说明这些蛋白的存在对抑制肿瘤的生长有重要意义。1433 epsilon和CA Ⅱ在HB肿瘤组织和HB细胞中表达的不一致，暗示HB肿瘤致病机理复杂，有必要对这些蛋白质的功能以及蛋白蛋白之间的相互作用作进一步分析研究。

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