流动注射后化学发光法测定阿米卡星

【摘要】 过氧化单硫酸盐具有很强的氧化性，本实验发现，在pH=11.5的条件下，过氧化单硫酸盐(PMS)可以氧化鲁米诺(Luminol)产生瞬时化学发光，发光结束后注入阿米卡星又会出现很强的慢速后化学发光。结合流动注射的方法，利用此体系建立了流动注射后化学发光测定阿米卡星的新方法，并对其后化学发光反应的动力学性质、化学发光光谱进行了研究，讨论了可能的反应机理。阿米卡星浓度在4.0×10-5～8.0×10-2 g/L范围内与发光强度呈良好的线性关系，检出限(3σ)为1×10-5 g/L，相对标准偏差为2.9%。本方法具有选择性好、操作简单、分析速度快和重复性好等优点，已成功用于尿液中阿米卡星含量的测定，结果令人满意。

【关键词】 流动注射，后化学发光，过氧化单硫酸盐，鲁米诺，阿米卡星

　　　　 1 引 言

　　阿米卡星(Amikacin，结构式为:)为半合成的氨基糖苷类抗生素，主要应用于治疗对卡那霉素和庆大霉素耐药革兰氏阴性杆菌所致的尿路、下呼吸道、腹腔、软组织、骨和关节、生殖系统等部位的感染以及败血症等。与其它氨基糖苷类抗生素一样，使用过程中对听觉和肾脏存在毒副作用，必须严格控制阿米卡星的临床用量[1]。

　　测定阿米卡星的药典方法为微生物法，但该法耗时长，操作复杂，灵敏度较低，且易被干扰。文献报道测定阿米卡星的方法有高效液相色谱法[2]、毛细管电泳法[3]、荧光法[4]、紫外分光光度法[5]及薄层色谱法[6]等。荧光法或紫外分光光度法测定时需要使用荧光试剂或其它试剂进行衍生，试样处理操作繁琐、干扰因素多。薄层色谱法操作程序过多，影响因素不易消除，分离效果较低，重现性较差。

　　化学发光分析结合流动注射技术分析法，因具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快和仪器操作简单等优点，使得化学发光检测法成为一种有效的痕量及超痕量分析技术，在药物分析领域得到了广泛的应用[7，8]。本研究组曾采用N溴代琥珀酰亚胺(NBS)荧光素体系化学发光法测定阿米卡星[9]，但选择性较差，不能直接用于生物样品中阿米卡星的测定。

　　过氧化单硫酸盐(HSO-5，Peroxymonosulfate，PMS)有较强的氧化性，可以在三聚盐过硫酸氢钾制剂(K2SO4·KHSO4·2KHSO5)中稳定存在。Magdaleno等[10]采用PMS直接氧化化学发光法来测定腐殖质;也有利用PMS的氧化性结合化学发光法测定一元羧酸[11]和荧光有机化合物[12]的报道。本研究发现，在碱性介质中鲁米诺可以被PMS氧化， 产生瞬时化学发光，发光结束后注入阿米卡星又会产生很强的慢速后化学发光，发光强度与阿米卡星浓度在一定范围内成正比。基于此，建立了测定痕量阿米卡星的流动注射后化学发光分析方法。与其它方法相比，本方法具有选择性好、操作简单、重现性好及快速等优点，已用于制剂和尿样中阿米卡星含量的测定。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　IFFMD型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈电子科技有限公司);精密pH计(上海雷池仪器厂);TU1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);F4600荧光分光光度计(日本日立公司)。0.01 mol/L PMS储备液：当天配制，准确称取三聚盐过硫酸氢钾制剂(K2SO4·KHSO4·2KHSO5，Alfa公司)0.3078 g溶解并定容至100 mL容量瓶中，使用时适当稀释。10 mmol/L鲁米诺储备液：准确称取1.77 g鲁米诺(陕西师范大学分析科学研究所合成)，P1， P2. 蠕动泵(Peristaltic); V. 进样阀(Valve); F. 流通池(Flow cell); PMT光电倍增管(Photoelectric multiplying tube); HV. 负高压(High voltage); PC. 计算机(Computer); R1. Peroxymonosulfate(PMS); R2. 鲁米诺(Luminol); R3. 样品(Sample); R4. 载流水(Carrier)用10 mL 1.0 mol/L NaOH溶解，加水定容于1000 mL容量瓶中，室温下放置7 d后使用。1.0 g/L阿米卡星储备液：准确称取50 mg硫酸阿米卡星(中国药品生物制品检定所提供)，溶于水中，定容至50 mL，使用时稀释到所需浓度。所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

　　2.2 实验方法

　　如图1连接流路，泵入PMS、鲁米诺、载流水和样品。测定样品的化学发光强度，以相对峰高定量。

　　3 结果与讨论

　　3.1 实验条件的优化

　　3.1.1 流速的影响 在本化学发光体系中，流速太慢会导致最大发光在流通池之前，流速太快会导致最大发光在流通池之后。本实验考察了0.8～2.5 mL/min范围内流速对化学发光强度的影响，主泵(图1中P1)流速为1.5 mL/min，副泵(图1中P2)流速为2.0 mL/min时，化学发光强度最大。

　　3.1.2 管道长度的影响 实验表明，鲁米诺和PMS的混合管长度L1为21.5 cm，混合池与流通池之间的反应管长度L2为5 cm时，化学发光信号最强。随着采样体积的增大，化学发光信号值也逐渐增大。但由于反应量的增多，导致反应不均匀，重现性下降。因此，在保证一定灵敏度的基础上，采样体积选择为100 μL。

　　分 析 化 学第37卷第10期闫瑞芳等：流动注射后化学发光法测定阿米卡星 3.1.3 鲁米诺和PMS浓度的影响 在5.0～250 μmol/L范围内，考察了鲁米诺浓度对发光强度的影响，结果表明，鲁米诺浓度为25 μmol/L时发光强度最大。在3.0～10 mmol/L范围内，考察了PMS浓度对发光强度的影响，结果表明，PMS浓度为6.0 mmol/L时发光强度最大。

　　3.1.4 缓冲溶液及其酸碱度的影响 本实验对10 mmol/L的Na2CO3NaHCO3，NaOH，Na2CO3，NaHCO3，NaHCO3NaOH，Na2B4O7NaOH，Kh3PO4H3PO4和Nah3PO4NaOH等几种缓冲溶液进行研究，通过实验最终确定最佳缓冲溶液为NaHCO3NaOH。在pH=10.0～12.0之间进行缓冲溶液酸碱度对发光强度的影响研究，结果表明缓冲溶液NaHCO3NaOH的pH=11.5时发光强度最大。

　　3.2 校准曲线、精密度及检出限

　　在最佳实验条件下，阿米卡星浓度在0.04～80 mg/L范围内与发光强度呈良好的线性关系。在0.04～0.4 mg/L范围内，校准曲线为ΔI=842.88C-14.724(r=0.9964);在0.4～80 mg/L范围内，校准曲线为ΔI=2607C+916.92(r=0.9991)。对4.0 mg/L阿米卡星进行了11次平行测定(图2)，相对标准偏差为2.9%;据IUPAC建议，计算出方法的检出限(3σ) 为0.01 mg/L。

　　3.3 干扰实验

　　在阿米卡星浓度为4.0 mg/L，相对误差±5%的条件下，研究了常见的共存物质及药品中的赋形剂对测定的干扰情况。结果表明，50倍的醋酸钠、酒石酸，30倍的Ca(NO3)2，20倍的草酸钠、β环糊精，10倍的淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、MgSO4，5倍的Fe(NO3)3，2倍的尿素，5倍的尿酸，不干扰测定。由于尿样中这些物质的实际含量均低于允许量，因此可不经分离或掩蔽，直接对样品进行测定。但Vc对样品的测定干扰较大(0.1倍)，需对尿样进行简单预处理。

　　3.4 实际样品测定

　　取10支阿米卡星注射液，混匀，逐级稀释至测定的线性范围内，按上述实验方法进行测定，并与紫 表1 阿米卡星制剂样品分析结果外分光光度方法进行比较，所得结果列于表1。取10 mL新鲜尿液，加入0.1 g NaCO3， 60 ℃微热10 min，消除Vc、谷胱甘肽等还原性物质[13]，冷却后，加入适量样品，离心分离。移取一定体积的离心上清液稀释100倍。按照上述实验方法操作，测得尿样浓度，计算回收率，并与紫外分光光度法比较，所得结果列于表2。表2 阿米卡星回收率实验结果

　　3.5 阿米卡星的后化学发光行为及其可能的机理

　　用IFFMD型化学发光分析仪采用静态法测定，研究了阿米卡星在PMS鲁米诺体系中的后化学发光行为。图2给出了PMS鲁米诺化学发光反应及阿米卡星在PMS鲁米诺体系中后化学发光反应的动力学曲线。当1.0 mL 6.0 mmol/L PMS溶液注入到1.0 mL 0.025 mmol/L鲁米诺溶液中时，立即发生了一个化学发光反应(峰1)，0.4 s后反应结束，化学发光信号回到基线。此时，向反应结束后的溶液中注入1.0 mL 40 mg/L阿米卡星溶液，又引发了一个新的、很强且很慢的后化学发光反应(峰2)，10 min后，反应结束，化学发光信号再次回落至基线。用空白溶液代替阿米卡星溶液进行实验，未检测到化学发光信号。以上实验表明：阿米卡星在PMS鲁米诺体系中有较慢的后化学发光反应。

　　用F4600荧光分光光度计分别测得PMS鲁米诺化学发光反应和PMS鲁米诺阿米卡星后化学发光反应的化学发光光谱(图3)。从图3可见，两个化学发光反应的最大发射波长均为425 nm，这说明PMS鲁米诺阿米卡星后化学发光反应与PMS鲁米诺化学发光反应具有相同的发光体。众所周知：鲁米诺化学发光反应的发光体是激发态的3氨基邻苯二甲酸根离子(3AP*)，图3 体系的化学发光光谱(A)和紫外吸收光谱(B)

　　Fig.3 CL spectra of reactions(A)and UV absorption spectrum (B)

　　A1. 6.0mmol/L PMS+25 μmol/L鲁米诺(Luminol); A2. 6.0 mmol/L PMS+25 μmol/L鲁米诺(Luminol)+4.0 mg/L阿米卡星(Amikacin); B1. 6.0 mmol/L PMS; B2. 40 mg/L阿米卡星(Amikacin); B3.(B1)+(B2)。从而可以确定所研究的后化学发光反应的发光体就是3AP*。在TU1901紫外可见分光光度计上分别扫描了PMS溶液、阿米卡星溶液、PMS和阿米卡星混合液的紫外可见吸收光谱。结果表明，阿米卡星的紫外吸收光谱在(191±2) nm处有一个吸收峰，而PMS阿米卡星混合液在192 nm处的特征吸收峰消失了。说明在碱性条件下PMS能够氧化阿米卡星。反应释放的能量，可能会转移给发光体，产生后化学发光。

参考文献

1 Hardman J G， Limbird L E. Goodman && Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics. 9th ed.， New York：Mc GrawHil， 1996： 1115～1116

　　2 Santos B， Sayalero M L， Zarzuelo A， Lanao J M. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol.， 2002， 25(2，3)： 287～297， 463～473

　　3 Yang W C， Yu A M， Chen H Y. J. Chromatogr. A， 2001， 905(12)： 309～318

　　4 ElShabrawy Y. Spectroscopy Lett.， 2002， 35(1)： 99～109

　　5 Zhang Wei(张 伟)， Deng YingJie(邓英杰). Journal of Shenyang Pharmaceutical University(沈阳药科大学学报)， 2000， 17(6)： 424～426

　　6 Argekar A P， Raj S V， kapadia S U. J. Planar ChromatogarMod. TLC， 1996， 9(6)： 459～461

　　7 Niu WeiFen(牛卫芬)， Lü JiuRu(吕九如). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2007， 35(2)： 281～284

　　8 Niu WeiFen(牛卫芬)， Lü JiuRu(吕九如). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2007， 35(4)： 564～566

　　9 Fang LuQiu(方卢秋)， Wang ZhouPing(王周平)， Fu ZhiFeng(付志锋)， Luo WanFen(罗万芬)， Zhang ZhuJun(章竹君). Journal of Southwest China Normal University(西南大学学报)， 2003， 28(4)： 603～605

　　10 Magdaleno G B， Coichev N. Anal. Chim. Acta， 2005， 552： 141～146

　　11 Wang M， Zhao L X， Lin J M. Luminescence， 2007， 22(3)： 182～188

　　12 Tsukada S， Miki H， Lin J M， Suzuki T， Yamada M. Anal. Chim. Acta， 1998， 371：163～170

　　13 Liu Mei(刘 梅)， He YunHua(何云华)， Lü JiuRu(吕九如). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2005， 33(4)：535～537