高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中泰拉霉素残留

　　　　 作者：刘勇军 ， 吴银良 姜艳彬 沈建忠

【摘要】 建立了高效液相色谱串联质谱(HPLCMS/MS)测定猪肉样品中新型兽药泰拉霉素残留的方法。样品用V(甲醇)∶V(0.1% H3PO4)=70∶30混合溶液提取，经离心后用PCX固相萃取小柱净化， 以SymmetryC8色谱柱为分离柱，在串联质谱多反应监测(MRM)模式下检测，内标法定量。方法的线性范围为10～500 μg/kg，检出限为5.0 μg/kg，在3个浓度水平(10，20和50 μg/kg)进行添加实验，平均回收率为93.1%～105.5%; 批内相对标准偏差为1.5%～4.6%; 批间相对标准偏差为1.8 %～5.6%。

【关键词】 高效液相色谱串联质谱， 猪肉， 泰拉霉素， 残留

　　　　　　1 引 言

　　泰拉霉素(Tulathromycin)是一种新近上市且为动物专用的大环内酯类半合成抗生素，分子式为 C41H79N3O12(分子量806)，其分子结构如图1所示。我国农业部在2008年第957号公告中首次批准使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放线杆菌、支原体、巴氏杆菌、副嗜血杆菌引起的猪、牛的呼吸系统疾病。具有用量少、一次给药、低残留、动物专用等优点[1，2]。我国广泛使用的大环内酯类药物为泰乐菌素和替米考星，虽然这两种药物的使用效果良好，但随着使用时间的延长， 图1 泰拉霉素分子结构式

　　Fig.1 Structure of tulathromycin在很多地区出现了不同程度的耐药性[3]，而泰拉霉素药效强于泰乐菌素、替米考星和氟苯尼考等市场广泛使用的大环内酯类药物，因此，泰拉霉素必将在畜禽生产中大量使用。作为一种新药，泰拉霉素的残留检测方法的研究尤为必要。目前，大环内酯类药物残留检测方法有ELISA筛选法[4]、薄层色谱法[5]、气质联用法[6]、高效液相色谱[7～10]和高效液相色谱串联质谱法等[11，12]。有关泰拉霉素的残留检测研究较少[13]。本研究建立了以罗红霉素(C41H76N2O15， 837)为内标的泰拉霉素的HPLCMS/MS检测方法，方法的定量限为10 μg/kg，可以满足有关法规对大环内酯类药物的检测要求，为动物组织中泰拉霉素的残留监控提供技术支持。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　Waters 2695 Quattro MicroTM API高效液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司);固相萃取仪(美国Supelco公司);PCX固相萃取柱(3 mL， 60 mg， Agela公司);T25B组织匀浆机(德国Ika公司);RE120旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);MS1Minishaker旋涡混合器;EEVAP水浴氮气吹干仪(美国Organomation公司);超纯水器(美国MilliQ公司)。

　　泰拉霉素标准品与罗红霉素内标(Sigma公司)、乙腈、甲醇、H3PO4为色谱纯;甲酸、Kh3PO4、　NH3·h3O为分析纯;实验室用水为MilliQ高纯水。

　　2.2 标准溶液的配制

　　泰拉霉素标准储备液：准确称取泰拉霉素10.0 mg，用V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH 6.0)定容至10 mL，摇匀，置冰箱冷藏储存，有效期3个月。内标物罗红霉素的配制方法同泰拉霉素。

　　添加溶液的配制：吸取储备液1 mL于100 mL容量瓶中并用V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH 6.0)混合液定容，再从中吸取1 mL于50 mL容量瓶中得添加液浓度为0.2 mg/L(冰箱冷藏储存，有效期2个月)。

　　2.3 内标物质的确定

　　由于大环内酯类药物的同位素内标物质很少， 至今无泰拉霉素同位素内标物出售。而测定大环内酯类药物的检测方法研究和标准修制订一般采用外标法或者采用大环内酯类某种结构相似药物作为内标物来进行定量分析。本实验选用一种没有用于兽药用途且结构与泰拉霉素非常相似的大环内酯类药物罗红霉素作为内标， 分子结构如图2所示。 图2 内标物罗红霉素分子结构式

　　Fig.2 Structure of roxithromycin as internal standard

　　2.4 供试样品溶液的制备

　　称取2.0 g组织样品于50 mL聚四氟乙烯塑料管中，加入10 mL提取液(V(甲醇)∶V(0.1% H3PO4)=70∶30)和适量内标工作液，7800 r/min匀质1 min后，5000 r/min离心2 min，收集上清液过已经分别用3 mL甲醇和3 mL提取液润洗过的60 g/3 L的PCX小柱，待全部过柱后，再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，最后用4 mL 4%氨化甲醇洗脱，50 ℃水浴氮气吹干后用1 mL流动相定容，进行HPLCMS/MS分析。

　　2.5 LCMS/MS分析条件

　　SymmetryC8柱(20 mm×3.9 mm， 5 μm)，流动相：V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30;柱温：30 ℃，进样室温度15 ℃，进样量：10 μL，流速为0.3 mL/min。

　　ESI(+); 多级反应检测(MRM); 毛细管电压： 4.2 kV; 锥孔电压： 20 V; RF透镜电压： 0.2 V; 离子源温度： 110 ℃; 脱溶剂气温度： 350 ℃; 锥孔气流速： 50 L/h; 脱溶剂气流速： 600 L/h; 倍增器电压： 650 V; 二级碰撞气： 氩气。

　　3 结果与讨论

　　3.1 样品的提取和净化

　　泰拉霉素含3个碱性的氨基基团，为弱碱性化合物，易溶于酸性溶液和极性溶剂中，在pH 6～8的水溶液中较稳定，在酸性(pH&<4)和碱性(pH&>9)条件下均不稳定。对泰拉霉素残留的提取和净化方法的设计主要依据其弱碱性、脂溶性和酸不稳定性。据文献[3]报道， 乙腈和甲醇是组织中大环内酯类药物常用的提取溶剂，且采用酸化的乙腈或甲醇为提取溶剂可促进大环内酯类抗生素从组织中溶出， 改善提取效率。本实验比较了4种提取液：乙腈0.1%偏磷酸(70∶30， V/V)、甲醇0.1%偏磷酸(70∶30， V/V)、乙腈0.1%磷酸(70∶30， V/V)和甲醇0.1%磷酸(70∶30， V/V)对泰拉霉素的提取效果。结果表明，甲醇0.1%磷酸(70∶30， V/V)提取液对泰拉霉素的提取效果较好，回收率高于其它提取液，故本实验选择甲醇0.1%磷酸(70∶30)为样品提取液。液液分配(LLE)和固相萃取(SPE)是大环内酯类药物的两种主要净化手段。液液分配操作比较麻烦且回收率相对较低， 重复性较差，所以本研究采用固相萃取技术净化。比较了C18、Oasis MCX和PCX3种SPE净化小柱， 由于Oasis MCX小柱和PCX小柱兼有阳离子交换和疏水作用机制，基于泰拉霉素的弱碱性和脂溶性的理化特性，Oasis MCX小柱和PCX小柱的净化效果优于C18小柱。Oasis MCX小柱和PCX小柱提取效率没有明显差别，但PCX小柱成本低，所以，本方法选择PCX小柱。

　　3.2 色谱与质谱条件的优化

　　3.2.1 液相色谱条件的优化 泰拉霉素是弱碱性和脂溶性的极性化合物，通过选择不同规格、不同填料的色谱柱和调节流动相中缓冲溶液的pH值、离子强度和有机溶剂(如乙腈或甲醇) 的含量，从而控制泰拉霉素的离子化强度和溶解性，使其在色谱柱上获得适当的保留和有效的分离。本实验选用了SymmetryC8柱(20 mm×3.9 mm， 5 μm)，Venusil ASB C18柱(30 mm×2.1 mm， 5 μm)， XTerra MSC18柱(15 mm×2.1 mm， 3.5 μm)和XDBC18柱(50 mm×1.0 mm， 5 μm)4种不同规格、不同填料的色谱柱进行实验。结果发现，选用SymmetryC8色谱柱时，基线平稳，峰形对称，重现性好。流动相优化实验发现，当流动相为V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30等度洗脱时，可使泰拉霉素在SymmetryC8色谱柱上得到较好的分离效果和较高的灵敏度。

　　3.2.2 质谱条件的优化 根据泰拉霉素的分子结构的特征，选择了ESI(+)为电离模式。通过流动注射直接进样，对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、RF透镜电压、质谱分辨率等条件进行了优化，并最终确定本方法质谱优化条件为：毛细管电压 4.2 kV，锥孔电压 20 V，RF透镜电压0.2 V，离子源温度 110 ℃，脱溶剂气温度 350 ℃，脱溶剂气流量600 L/h 。质谱图见图3，母离子、子离子以及定性、定量离子对见表1。表1 泰拉霉素的定性、定量离子

　　3.3 样品基质效应的消除

　　电喷雾离子化( ESI)方法容易受样品基质的影响。实验发现， 样品基质对离子化有非常强的抑制作用。为消除样品基质效应，以待测样品制备对应的空白样品提取液，并以其作为标准溶液的稀释溶液，可使标准和样品溶液具有同样的离子化条件。

　　3.4 方法学考察

　　3.4.1 方法的线性范围与检出限、定量限 在上述条件下，以基质添加标准曲线内标法定量(标准品色谱图如图4所示)，泰拉霉素质量浓度为10～500 μg/L时，线性关系良好，线性方程为Y=90.835X+0.187，(r=0.9993)。泰拉霉素的检出限为5 μg/kg(S/N&>3)，定量限为10 μg/kg(S/N&>10)，超过了国内相关标准对大环内酯类药物检测的灵敏度要求。

　　图4 罗红霉素(A)内标物和泰拉霉素(B，C)的色谱图

　　Fig.4 Chromatograms of roxithromycin (A) as internal standard and tulathromycin (B， C)3.4.2 方法的回收率与精密度 取适量空白猪肉，进行3个浓度水平(10，20和50 μg/kg)的添加回收实验，每个水平取5个平行样(添加和空白色谱图见图5)，结果见表2所示。方法的回收率为93.1%～105.5%; 批内相对标准偏差为1.5%～4.6%; 批间相对标准偏差为1.8 %～5.6%; 满足了药物残留分析的要求。表2 方法回收率及精密度

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