竞争包结法研究印楝素与β环糊精及其衍生物的选择键合

【摘要】 以酚酞作为光谱探针，采用紫外可见光谱滴定法测定了β环糊精(βCD)，单(6脱氧乙二胺)β环糊精(enβCD)，单(6脱氧二乙基三胺)β环糊精(dienβCD)，七(2，3，6三O甲基)β环糊精(TMβCD)，七(2，6二O甲基)β环糊精(DMβCD)，2羟丙基β环糊精(HPβCD) 在25 ℃时，pH=10.5缓冲液中与两种印楝素客体分子所形成超分子配合物的稳定常数。结果表明，多种弱相互作用力协同作用于环糊精的配位过程，主客体间的尺寸匹配决定所形成配合物的稳定性，环糊精衍生物的取代基影响主体配位能力。6种环糊精主体化合物对印楝素客体分子的包合能力的大小为：HPβCD&> enβCD≈dienβCD&>βCD&> DMβCD≈TMβCD。对印楝素A和B给出相似的键合能力。

【关键词】 β环糊精，酚酞， 印楝素，竞争包结， 选择键合

　　 1 引 言

　　近年来，人们对印楝的提取物作为昆虫拒食剂、昆虫生长调节剂的活性和应用进行了广泛的研究[1]。印楝提取物作为天然药物的应用也被广泛研究和报道[2，3]。在被称为柠檬素的四环三萜类提取物中，印楝素A (Azadirachtin A， AZA)和印楝素B (3Tigloylazadirachtol，AZB)(结构见图1) 是最主要的活性化合物[4]。然而，印楝素的应用前景受到其自身低水溶性和不稳定性的限制[5]，引入一些无毒的助溶剂可提高印楝素水溶性和稳定性，如李云寿[6]和徐汉虹[7]等制备了含有各种添加剂的印楝素微乳剂，但未能使印楝素真正溶解在水中。

　　环糊精分子具有疏水性空腔和亲水性表面，其空腔可以在水溶液中装载不同的有机客体分子，形成主客体配合物或超分子体系，可增强客体分子的水溶性，改变客体分子的理化性能[8，9]。近年来，关于β环糊精及其衍生物与印楝素包结行为机理和包合物水溶性、稳定性的研究已有报道，为制备含有印楝素的水溶性、高生物活性和低毒性的生物农药和保健药物提供新的途径[10，11]。

　　然而，印楝素的紫外最大吸收峰靠近200 nm，天然环糊精和修饰环糊精都有吸收干扰，常规的紫外光谱滴定法不能测量印楝素的配位稳定常数。另外，由于此配位包合过程的热焓较低，量热滴定法也无法实施[10]，采用紫外和荧光竞争包结法研究光学惰性客体与环糊精的配位稳定常数是一种合理、有效的方法[11～13]。因此，本研究采用酚酞为光谱探针，利用竞争包结法测定印楝素A和B与β环糊精及其衍生物的配位稳定常数，研究了印楝素和环糊精的选择性键合。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　UV 3600紫外可见分光光谱仪(日本岛津公司)。印楝素A和B(纯度均为90%，由本实验室从印楝种仁中提取，经过柱层析分离纯化);乙二胺β环糊精[enβCD，MS (ESI): m/z 1177.43 (M+H+); 1H NMR (D2O， TMS， ppm): δ 2.4～2.9 (m， 4H)， 3.2～4.0 (m， 42H)， 4.90 (s， 7H)]和双乙二胺β环糊精[dienβCD，MS (ESI): m/z 1120.43 (M+H+); 1H NMR (D2O， TMS， ppm): δ 2.4～2.9 (m， 8H)， 3.2～4.0 (m， 42H)， 4.90 (s， 7H)]分别根据文献[14，15]报道的工艺过程制备;2，3，6全甲基化β环糊精(TMβCD)，2，6甲基化β环糊精(DMβCD)，β环糊精和羟丙基β环糊精(HPβCD， 平均摩尔取代度为7.0)为商品化试剂(百灵威化学技术有限公司);酚酞(分析纯，上海试剂三厂)。其它试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。V(乙醇)∶V(水)= 1∶5混合液用于紫外可见光谱实验。0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3缓冲体系(pH 10.5)。

　　2.2 光谱滴定实验

　　准确移取1 mL 2.35×10-4 mol/L酚酞于10 mL容量瓶中，加入0.005～0.5 mol/L 的环糊精溶液，采用0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3缓冲体系控制溶液的pH为10.5，用V(乙醇)∶V(水)=1∶5混合液定容。在(25±1)℃下放置1 h，扫描紫外光谱，特定吸收波长为553 nm，其生色基团的最大吸收值呈规律下降，测量出每一环糊精浓度对应的ΔA。然后固定酚酞的浓度为3×10-4 mol/L，环糊精的浓度为5×10-4 mol/L，加入印楝素，于0.005～0.5 mol/L的范围内逐渐增大印楝素的浓度，在(25±1)℃下放置1 h，测量出每种印楝素浓度对应的ΔA。

　　3 结果和讨论

　　3.1 光谱滴定

　　在竞争包结法测定超分子配合物的稳定常数时，酚酞的分子尺寸与β环糊精的空腔尺寸匹配较好，因此pH 10.5的酚酞可以作为光谱探针[12]，测定印楝素和β环糊精及其衍生物的配位稳定常数。由于印楝素在水中较低的溶解度，实验在25 ℃下V(乙醇)∶V(水)= 1∶5混合液中进行。文献[13]报道，环糊精(CD)与酚酞(PP)客体形成超分子包结配合物的化学计量为1∶1时，其配位稳定常数K′s和解离常数Kd可以通过公式(1)来表示：K′s=1/Kd=[PP]=([CD]0-ΔA/Δε)([PP]0-ΔA/Δε)ΔA/Δε(1)其中，0和 [PP]0分别是环糊精和酚酞的初始浓度，加入客体后环糊精的吸光度变化ΔA定义为ΔA=A0(无主体)-A(加入主体)，形成超分子配合物后ΔA可以表示为ΔA=Δε，Δε是主客体配位前后的摩尔吸光系数变化，由方程(1)可获得方程(2):ΔΑ=Δε[CD]0+[PP]0+K′s)-(Δε)2([CD]0+[PP]0+K′s)2-4(Δε)2[CD]0[PP]02(2) 将测得的实验数据代入上面的公式(2)中，根据非线性最小二乘曲线拟合的方法可以求得超分子配合物的分离常数(Kd)和摩尔吸光系数(Δε)[16]。图2给出了主体环糊精与印楝素客体包结配位的曲线拟合结果，良好的线性关系进一步表明主客体之间形成的超分子配合物的化学计量为1∶1。稳定常数值是根据至少7个不同浓度的天然环糊精主体分子引起的客体光谱变化得出的平均值，其标准偏差小于±5%。保持恒定的主体环糊精和客体酚酞浓度，加入印楝素到此系统中，形成另一平衡。印楝素和环糊精的配位稳定常数Ks可由方程(3)计算而得：Ks=(c0-c)-(a0-a)c[b0-(c0-c)+(a0-a)](3)

　　a=a0=ΔAΔε=(ΔΑ∞-ΔΑ)Δε(4)

　　c=Kd(a0-a)a(5) 其中，a0， b0和 c0分别是酚酞、印楝素和环糊精的初始浓度， a、b和c分别是酚酞，印楝素和环糊精的平衡浓度[13]，方程(4)和(5)的结果代入方程(3)可计算得到印楝素和环糊精的配位稳定常数。

　　图3给出了酚酞和印楝素客体竞争包结β环糊精的结果，酚酞的吸光度随着印楝素比例增加，呈现规律性的上升。测量数据带入方程得到的配位稳定常数Ks和相应的自由能变化(-ΔG°)列入表1。表1中的稳定常数值是根据至少5个不同浓度的印楝素引起的客体光谱变化得出的平均值。

　　图2 不同enβCD浓度的吸收光谱图(插图为计算分离常数(Kd)和摩尔吸光系数( Δε )的非线性拟合

　　Fig.2 Absorption spectra of host enβCD; inset：the nonlinear least squares analysis of the differential intensity (at 553 nm) to calculate the separation constant(Kd) and molar absorbance constant (Δε)

　　酚酞(phenolphthalein): 3×10-5 mol/L; 介质(medium): 乙醇水(ethanol/water， 1∶5， V/V， pH 10.5)。a～g：enβCD 0～1×10-3 mol/L。 图3 enβCD和AZB对酚酞紫外可见光谱的影响

　　Fig.3 Effect of enβD and AZB on the UV/vis spectrophotometric of phenolphthalein

　　a. 3×10-5 mol/L 酚酞(phenolphthalein); b.(a)+ 5×10-4 mol/L enβCD; c～g. (b)+ AZB (5×10-4～5×10-3 mol/L);介质(medium): 乙醇水 (ethanol/water， 1∶5， V/V， pH 10.5)。

　　3.2 键合能力和选择性

　　大小/尺寸适合理论在众多的主客体包结配合物形成的过程中起决定性的作用。在该理论的基础上，已知各种弱相互作用，如离子偶极，偶极偶极，范德华力，静电相互作用，氢键和疏水相互作用协同贡献于主客体包结配位作用。从表1可以发现以下规律：表1 客体AZA和AZA与主体βCD， enβCD， dienβCD， TMβCD， DMβCD和HPCD在25 ℃ pH 10.5 V(水)∶V(乙醇)=5∶1)混合缓冲溶液中包合稳定常数(Ks) 和吉布斯自由能变化(-ΔG°)

　　Table 1 Complex stability constant(Ks) and Gibbs free energy change(-ΔG) for inclusion complexation of AZA and AZB guest with various host βcyclodextrin(βCD)， mono(6ethylenediamino6deoxy)βcyclodextrin(enβCD)， mono(6diethylenetriamino 6deoxy)βcyclodextrin(dienβCD)， heptakis(2，3，6triOmethyl)βcyclodextrin(TMβCD)， dimethylβcyclodextrin(DMβCD) and hydroxypropylβcyclodextrin(HPCD) in aqueous buffer water/ethanol(5∶1， V∶V) mixed solution(pH 10.5) at 25 ℃主体

　　Host客体

　　Guest稳定常数

　　K(L/mol)logKs-G°

　　(kJ/mol)主体

　　Host客体

　　Guest稳定常数

　　K(L/mol)logKs-G°

　　(kJ/mol) βCDenβCDdienβCDTMβCDDMβCDHPβCDAZA290±20b2.4614.01010±50b3.0017.1950±50b2.9817.0210±20b2.3213.2220±20b2.3413.41150±50b3.0617.5 βCDenβCDdienβCDTMβCDDMβCDHPβCDAZB310±20a2.4914.21080±50a3.0317.31010±50a3.0017.1210±20b2.3213.2230±20b2.3613.51240±50b3.0917.6a: 文献[20]， 在水/乙醇混合溶液(5∶1， V/V)(reference [190]， in a water/ethanol(5∶1，V∶V) mixed solution); b: 本工作(this work)。3.2.1 βCD， enβCD 和dienβCD对印楝素的配位包结能力比较 相比天然的βCD， enβCD 和 dienβCD能够同印楝素A和B形成更稳定的配合物，因为βCD 的单氨基取代可以造成多种协同的分子间弱相互作用从而增强配位包结能力[18]。由此可以推断，相比天然的βCD，客体印楝素A和B能与单氨基取代的βCD 形成更好的配位包结。比较分析主客体的结构特征可知，enβCD 或dienβCD的乙烯基二胺长臂能够调整定位于印楝素A和B分子，其氮原子上的孤对电子与印楝素A和B分子上的氢原子或羟基形成氢健，从而增强了主客体的配位包结协同作用。所以，enβCD和dienβCD 显示了与印楝素A和B分子更为显著的配位包结能力。

　　3.2.2 βCD， DMβCD和TMβCD对印楝素的配位包结能力比较 环糊精的空腔具有一定刚性，因此在与客体分子包结配位时，客体分子与环糊精主体的尺寸匹配在其配位过程中起主要作用。印楝素与甲基化(环糊精配位包结，给出较小的稳定常数：βCD &>DEβCD&>TMβCD。原因是，环糊精外缘拥有许多的甲氧基而不是羟基，使得甲基化βCD比起天然βCD拥有一个较大的空腔开口和更深的空腔[19]。由于主客体间严格的尺寸适合，甲基化βCD的结构特征使得它与印楝素分子的包结配位行为较弱。另外，文献[20]报道，氢健对配位包结能力具有较大的影响。将环糊精空腔外壁的羟基转化为甲氧基后，印楝素与甲基化βCD的分子间氢健减弱甚至可以忽略，因此，获得印楝素与甲基化βCD的配位稳定常数较小。

　　3.2.3 βCD 和 HPβCD对印楝素的配位包结能力比较 对于HPβCD与印楝的包合表现出较大的稳定常数，原因是其羟丙基取代基的引入相对于原有的仲羟基显然可以扩展环糊精的疏水空腔。另一方面，这种取代基可以自包结进入自身环糊精空腔使其有效空腔尺寸减小，从而与分子体积匹配的客体产生更为有效的范德华相互作用[13]，可以推测，经过调节后的HPβCD空腔与印楝素分子尺寸匹配较好，同印楝素A和B形成更稳定的配合物。

　　3.2.4 βCD及其衍生物对印楝素A和B的配位包结能力比较 从结构上看，印楝素A和B有相似的结构。本研究组的前期工作[16]对印楝包结模式的研究表明，环糊精主要包结印楝B的A环基团，合理的推演，印楝A的A环基团进入环糊精空腔也是主要包结模式。因此，印楝A和B与β环糊精及其衍生物表现了相似的稳定常数。

　　结果表明，酚酞作为一种光谱上的分子探针可以研究β环糊精及其衍生物对复杂分子印楝素的分子识别，揭示主客体间的几何互补性、氢健以及疏水性等对活性客体分子选择性键合的重要作用

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