液相色谱串联质谱测定面条和米粉中的硫脲

　　　　作者：黄晓兰 罗辉泰 吴惠勤 陈文锐　邹志飞 黄芳 林晓珊 朱志鑫

【摘要】 建立了米面制品中硫脲的液相色谱串联质谱(LCMS/MS)测定方法。实验优化了样品提取方法、液相色谱条件和质谱参数。样品用80%乙醇超声波提取，离子交换色谱分离，色谱柱为NUCLEOSIL 1005SA 阳离子交换柱，流动相为乙腈(1%乙酸+0.2%乙酸铵)水溶液(30∶70)，流速0.5mL/min。采用电喷雾质谱正离子模式电离，多反应选择离子检测，检测离子对为m/z 77/60和m/z 77/43，其中m/z 77/60为定量离子对。结果表明: 本方法简便快速、准确可靠，相对标准偏差&<4.0%;回收率为83%～90%;检出限为0.5 mg/kg;定量下限为 5 mg/kg。

【关键词】 硫脲， 液相色谱， 串联质谱， 面条， 米粉

　　 1 引 言

　　硫脲(thiourea)又称硫代尿素，是一种纺织品的化学漂白剂，曾一度作为防腐剂，广泛用于各类需要漂白、保鲜防腐的食品。向食品中加入硫脲可阻止褐变，表观光亮，略带半透明。硫脲被人体摄入后危害健康，抑制甲状腺和造血器官的机能，引起中枢神经麻痹及呼吸和心脏功能降低等，甚至导致死亡。由于硫脲毒性大，我国已不允许其作为食品添加剂使用。近年有报道，我国东南沿海曾有用硫脲作为面条的增白剂、增筋剂，而目前我国尚无食品中硫脲测定的相关标准方法。在当今食品安全问题严峻的状况下，迫切需要尽快建立其检测方法。

　　目前，空气、水、土壤和生物等材料中硫脲的检测方法已有报道[1～4] ，通常采用高效液相色谱法;Raffaelli等[5]报道了用大气压化学电离质谱法测定废水中的硫脲。但至今未见食品中硫脲检测的相关报道。由于食品基质复杂，采用液相色谱法干扰很大，且灵敏度较低。本研究采用液相色谱串联质谱(LCMS/MS)法检测面条和米粉中的硫脲，考察了样品的提取方法，优化了色谱条件和质谱条件。本方法简便快速、准确可靠，检出限为0.5 mg/kg;定量下限为5 mg/kg，适用于面条、米粉等米面制品中硫脲的测定。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　Agilent 1200LC/6410B MS液相色谱/串联四级杆质谱联用仪;AS 3120超声波发生器(Auto Science公司)， 功率250 W，频率33 kHz。

　　硫脲(Thiourea，纯度≥98.0%);硫脲标准溶液的配制：以水为溶剂配制质量浓度为1000 mg/L的标准溶液，经0.22 μm滤膜过滤后作为储备液。使用时用水逐级稀释至所需浓度;乙腈和甲醇(HPLC级);乙酸、乙酸胺、乙醇等(分析纯，广州化学试剂厂);实验用水为二次蒸馏水。

　　2.2 样品预处理

　　将样品用粉碎机粉碎，取 2.0 g 粉碎后的样品置于具塞三角瓶中，加入20.0 mL 80%乙醇溶液，盖上盖，超声波振荡提取15 min，将超声波提取后的样品混合物全部转移至离心管中，以3500 r/min离心15 min。移取上清液10.0 mL 至50 mL烧杯中，在68 ℃水浴上浓缩至约1 mL。然后转移至5 mL刻度试管中，用水洗涤烧杯多次，洗涤液合并入1.0 mL刻度的梨形瓶中，在50 ℃下吹氮浓缩定容至1.0 mL。

　　2.3 LCMS/MS测定

　　2.3.1 HPLC条件 色谱柱：NUCLEOSIL 1005SA 阳离子交换柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm); 流动相：乙腈(1% 乙酸+0.2% 乙酸铵)水溶液(30∶70， V/V)，流速0.5 mL/min。进样量5.0 μL。

　　2.3.2 质谱条件 电喷雾(ESI)正离子电离模式。干燥气(N2)温度350 ℃;雾化气(N2)压力276 kPa;干燥气(N2)流量9.00 L/min;电喷雾电压4000 V;检测离子对为 m/z 77/60和m/z 77/43，其中m/z 77/60为定量离子对;采集时间 200 ms;碎裂电压 80 V;碰撞能量 36 V(m/z 77/60)和48 V(m/z 77/43)。

　　2.3.3 测定方法 取样品溶液和标准溶液各5.0 μL注入液相色谱串联四级杆质谱仪进行分析，以其标准溶液峰的保留时间和质谱检测离子对 m/z 77/60 和 m/z 77/43 为依据进行定性分析，以定量离子对 m/z 77/60 的峰面积计算样品中硫脲的含量。

　　3 结果与讨论

　　3.1 液相色谱条件的优化

　　考察了C18柱、C8柱、Nh3键合相柱及阳离子交换柱对硫脲分离的影响。结果表明：采用C18色谱柱时，当流动相为乙腈水体系时[4]，硫脲几乎无保留;当乙腈比例降低至10%时，硫脲仅有少许保留，保留时间为2.7 min(色谱柱规格为250 mm×4.6 mm，流速为1.0 mL/min，下同);当在流动相中添加庚烷磺酸盐离子对试剂时，硫脲的保留时间并无明显增加。采用C8色谱柱时，当流动相为乙腈庚烷磺酸盐体系时，随着乙腈比例从65%，40%至5%逐渐减少，硫脲的保留时间从2.9 min， 3.0 min至3.3 min逐步增加，但保留时间仍太短。采用Nh3键合相色谱柱时，当流动相为乙腈水体系时，随着乙腈比例依次从70%， 80%， 90%增加到100%，硫脲的保留时间也从3.47 min， 3.55 min， 3.65 min延长到3.79 min，但增加幅度不大，保留时间较短，且峰形较宽。采用阳离子交换色谱柱时，当流动相为乙腈磷酸盐缓冲液和乙腈乙酸铵缓冲液体系时，乙腈比例为30%时，硫脲的保留时间为3.4 min，峰形较理想;随着乙腈比例的减少，硫脲的保留时间虽逐步增加，但增加幅度不大且色谱峰展宽严重;改变缓冲液的浓度和pH值，硫脲的保留时间并无明显改变。

　　以上实验表明，硫脲由于相对分子质量很小，极性较强，在各类型的色谱柱上保留时间均较小，用液相色谱紫外检测法测定实际样品时受到的干扰较严重。因此采用液相色谱串联质谱法测定。考虑到质谱法测定不能使用离子对试剂、磷酸盐缓冲液作流动相，并综合考虑保留时间和色谱峰形，故选择阳离子交换色谱柱和乙腈乙酸铵缓冲液体系。经实验本方法最终选择的色谱柱为NUCLEOSIL 1005SA 阳离子交换柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相为乙腈(1%乙酸+0.2%乙酸铵)水溶液(30∶70，V/V)，流速0.5 mL/min。此条件下硫脲的保留时间为6.7 min，峰形较好。

　　3.2 质谱参数的优化

　　用0.5 mg/L硫脲标准溶液，采用ESI正离子模式进行一级质谱扫描，得到硫脲准分子离子峰m/z 77，即[M+H]+。以m/z 77为母离子作二级质谱，得到硫脲碎片离子峰m/z 60和43，即[M+H-NH3]+和[M+H-h3S]+。选择m/z 77/60和m/z 77/43离子对进行MRM模式检测，并对各质谱参数进行优化。优化后的质谱条件见2.3.2节。硫脲的(+)ESI二级质谱图见图1。优化后的硫脲标准溶液的HPLCMS/MS色谱图见图2。

　　3.3 样品前处理条件的优化

　　3.3.1 不同提取剂对硫脲提取效果的影响 比较了用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水作提取剂的提取效果。在2.0 g 粉碎后的面条样品中加入11.6 mg/L硫脲标准溶液1.0 mL，待溶液完全被样品吸收后，再分别用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水进行超声波振荡提取。按前述LCMS/MS方法测定硫脲的提取效率。结果表明，氯仿几乎无法提取出硫脲，甲醇、乙醇、乙腈和水的提取效率分别为 86.5%， 70.0%， 67.1%和88.3%，可见以水作提取剂的效率最高。但用水提取时，样品中的淀粉及其它添加剂也会被提取出来，导致提取液混浊且粘稠，后续处理很麻烦;而用甲醇和乙醇提取虽然效率略低，但提取液较干净，处理过程简便快捷。因此结合二者的优点，考虑用甲醇或乙醇和水的混合溶剂进行提取。分别考察了甲醇比例为20%～80%时的提取效果和乙醇比例为20%～80%时的提取效果，结果见表1。由表1可见，80%乙醇水混合溶剂的提取效果最佳。表1 不同比例的醇和水对硫脲的提取效果

　　3.3.2 提取时间对硫脲提取效果的影响 考察了超声波提取10， 15， 20， 25和30 min时的提取效果，其回收率分别为87.3%， 88.1%， 86.3%， 85.6%和85.8%。可见超声波提取时间对硫脲的提取效果影响不明显，超声10 min后提取率已基本稳定。本实验选择超声波提取时间为15 min，可满足分析要求。

　　综合以上结果，确定样品的最佳前处理条件为2.2节所述。由于采用MRM方式测定，避免了样品基体杂质的干扰，故样品提取后无需净化即可直接上机分析，简便快速，回收率较高。

　　3.4 线性范围、线性方程与检出限

　　取硫脲标准储备液逐级稀释成0.501，1.002，2.004，5.01，10.02和20.04 mg/L的系列标准溶液，进行LCMS/MS分析。以峰面积(A)和质量浓度(ρ，mg/L)作定量工作曲线，线性方程为A=1209ρ-30.91，相关系数为0.9999，在0.5～20 mg/L浓度范围内线性关系良好。当样品中的硫脲超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。以信噪比S/N=3确定样品的检出限为0.5 mg/kg，采用标准添加法进行实测确定硫脲的定量下限为5.0 mg/kg，可满足米面制品中对硫脲的检测要求。

　　3.5 回收率和精密度

　　取不含硫脲的面条和米粉样品各3组，分别加入5.01，10.02和50.10 mg/kg硫脲标准溶液，待完全被样品吸收后，按实验方法测定硫脲的回收率，每组样品平行测定6次，结果见表2。由表2可见，面条样品中硫脲在添加水平5～50 mg/kg，其回收率为83%～89%，相对标准偏差为0.8%～4.0%;米粉样品中硫脲在添加水平5～50 mg/kg，其回收率为88%～90%，相对标准偏差为1.7%～3.3%。面条空白及加标样品的HPLCMS/MS总离子流色谱图见图3a和b。本方法回收率较难达到90%以上，可能是基质表2 标准加入样品中硫脲的回收率和相对标准偏差

参考文献

1 Stuttgart， Hirzel S， BUA (1995) Thiourea. German Chemical Society (GDCh) Advisory Committee on Existing Chemicals of Environmental Relevance (BUA). Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft(BUA Report 179)

　　2 Hashimoto A. Anal. Chem.， 1979， 51(3): 385～387

　　3 Kobayashi H， Matano O， Goto S. Journal of Chromatography， 1981， 207: 281～285

　　4 Aulakh J S， Sharma V K， Mahajan R K， Malik A K. Electronic Journal of Environmental， Agricultural and Food Chemistry， 2004， 3(5): 751～757

　　5 Raffaelli A， Pucci S， Lazzaroni R， Salvadori P. Rapid Commun Mass Spectrom， 1997， 11: 259～264