固相萃取反相高效液相色谱荧光检测法测定拟南芥中的生长素

　　　　 作者：符继红 褚金芳 王吉德 闫存玉

【摘要】 建立了固相萃取反相高效液相色谱荧光检测法测定拟南芥中生长素的方法。采用Waters sunfire C18(150 mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以乙腈10 mmol/L乙酸钠(20∶80， V/V，乙酸调节至pH 3.5)为流动相，在流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温20 ℃，样品温度10 ℃，荧光激发和发射波长分别为275和345 nm条件下，分离测定了拟南芥中的植物生长素吲哚乙酸和吲哚丙酸含量。分离效果良好，线性范围分别为85.71 pg～21.43 ng和0.33 ng～1.29μg，相关系数分别为0.9992和0.9999，相对标准偏差小于5%，平均回收率分别为103.8%和102.6%。本方法可对少量模式植物样品进行灵敏、准确的定量分析。

【关键词】 固相萃取，生长素，吲哚乙酸，吲哚丙酸，拟南芥，高效液相色谱

　1 引 言

　　植物激素是在植物体内某一部位合成，并可转移到其它部位，调节植物生长发育具有显著的微量有机物。植物激素在植物生长发育过程中发挥着重要作用[1]。植物功能基因对植物生长发育起到的精细调控作用通常以植物激素的形式体现出来，植物激素含量的微小变化就能够引起植物明显的生理变化，对其进行提取和测定非常困难。生长素是最早发现的一种植物激素，主要功能是促进植物生长、细胞分裂和分化[2]。由于其在植物体内含量甚微，所以从少量样品中分离测定生长素具有重要的意义。

　　近年来，检测植物激素主要采用气相色谱质谱联用(GCMS)和液相色谱质谱联用(LCMS)技术。但是GCMS方法要求样品的衍生化以提高挥发性和灵敏度，样品处理过程复杂费时。LCMS/MS技术虽然有较高的灵敏度和选择性，同位素内标物的使用使其定量更为准确[3～7]。但由于仪器和内标物的昂贵，限制了该方法的广泛应用。高效液相色谱(HPLC)是一种通用的分析仪器，其在植物激素测定研究中已有报道，但因生物体内激素的复杂性与特殊性，使其有效成分的提取分离成为极为关键的一步。HPLC法测定多种植物内源激素时经常发生分离差、峰型不良及严重拖尾现象[8]，且样品用量一般要求较多[9，10]，对一些特殊样品无法实现测试要求。因此，选择合适的植物激素提取方法和色谱条件尤为重要。

　　本研究建立的固相萃取高效液相色谱(HPLC)荧光检测法可以准确测定植物中的生长素类物质，样品用量少，可以满足普通分析实验室完成相关测试的要求。拟南芥(Arabidopsis thaliana)属被子植物，双子叶分纲，属十字花科。因其具有生命周期短、自花授粉、核基因组小，结构简单等优点，是植物细胞遗传学研究的经典模式材料[11]。建立拟南芥中植物激素生长素含量的测定方法对有关生长素作用机制及信号转导途径的研究具有重要意义。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配备Waters Empower化学工作站、Waters 2475荧光检测器、Waters sunfire C18色谱柱(150 mm×4.6 mm， 5 μm)、C18固相萃取小柱;旋转蒸发仪(德国Heidolph公司); Himac CR 22G高速离心机(日本日立公司)。乙腈(色谱纯， Fisher公司);乙酸钠(分析纯， 北京化工厂);乙酸(分析纯， 国药集团化学试剂有限公司);吲哚乙酸(IAA)和吲哚丙酸(IPA)生长素标准品(Sigma公司);铜试剂(二乙基二硫代氨基甲酸钠，纯度≥99.0%，Sigma公司);实验用水为ULTRA AN MK2超纯水仪(ELGA公司)制备的超纯水;拟南芥(中科院遗传与发育生物学研究所种植，生长期12 d，长日照，16 h光照，8 h黑暗。温度21～23 ℃，湿度50%～60%，光照强度80～120 μmol/(s·m2)。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 标准溶液的配制 根据拟南芥中生长素含量范围确定标样浓度[9]。准确称取0.05357 g吲哚乙酸和0.06458 g吲哚丙酸，用80%甲醇溶解并定容至25 mL，配制成2.14 g/L吲哚乙酸和2.58 g/L吲哚丙酸标准溶液。相应低浓度生长素标准液用80%甲醇稀释而成。

　　2.2.2 色谱条件 Waters sunfire C18色谱柱(150 mm×4.6 mm， 5 μm);流动相：乙腈10 mmol/L乙酸钠(20:80， V/V，乙酸调节至pH 3.5);流速1 mL/min ，进样量20 μL。柱温20 ℃;样品温度10 ℃;荧光激发和发射波长分别为275和345 nm。

　　2.2.3 样品处理 将实验用拟南芥样品液氮速冻，然后用液氮预冷的研钵充分研磨，置于-70 ℃超低温冰箱中备用。称取250 mg粉碎好的样品于三角瓶中，加入4 mL 80%甲醇溶液(含0.3 mmol/L铜试剂)，在-20 ℃放置过夜，移至离心管，在4 ℃以15000 r/min离心20 min，取上清液，沉淀中再加入4 mL 80%甲醇溶液(含0.3 mmol/L铜试剂)浸泡2 h，在4 ℃以15000 r/min再次离心20 min，合并两次上清液。Waters C18(200 mg，3 cc)固相萃取小柱依次用10 mL乙醇、20 mL 超纯水、10 mL 80%甲醇溶液淋洗。将合并的上清液注入小柱，收集流出液，然后用6 mL 80%甲醇溶液淋洗，继续收集流出液，合并。将样品在35 ℃减压蒸发至干，用1 mL 80% 甲醇溶解，经0.2 μm微孔滤膜过滤， 进样。

　　3 结果与讨论

　　3.1 提取条件的选择

　　HPLC方法很难直接检测植物激素的原因之一是植物激素在植物体内的含量非常低，因此有效提取是检测的关键。样品经甲醇提取后，溶液浑浊，含有很多杂质。必须采用固相萃取柱进行预处理。本实验采用C18小柱吸附大量杂质，使目标化合物吲哚乙酸(IAA)和吲哚丙酸(IPA)直接洗脱。实验中先用10 mL乙醇、20 mL 超纯水活化固定相，并除去固定相中的杂质，再用10 mL 80%甲醇溶液平衡，创造适合上样的环境。以80%甲醇为洗脱液可以使对生长素有干扰的杂质较好地被C18柱保留，又使IAA和IPA几乎没有任何损失的洗脱。标准品在C18小柱上的平均回收率分别为98.45%和98.10%，方法更为简单和快速。

　　3.2 色谱条件的选择

　　以乙腈水作为流动相，色谱峰拖尾严重，峰形极差。乙酸钠乙酸缓冲液可以抑制样品的电离、改善拖尾现象。实验对流动相的pH值进行了考察。用乙酸调节其pH值分别为3.2，3.5，3.8和4.0。实验表明，当pH值为3.8和4.0时，峰形有一定脱尾;pH值为3.2和3.5时，峰形较好，没有差异。IAA的pKa为4.75，在流动相pH&<3.8时，主要以分子形式存在，在色谱柱上可获得到较好的保留。同时，IPA在此色谱条件下也能够得到较好的峰形。考虑到在较低pH条件下(pH&<2.0)生长素稳定性受到影响，因此选用pH 3.5的乙酸钠缓冲溶液为流动相。比较了不同比例的10 mmol/L乙酸钠乙腈流动相，随着乙腈比例的提高，吲哚乙酸和吲哚丙酸保留时间提前， 但使分离效果降低;乙腈比例过低，保留时间太长。当V(乙腈)∶V(10 mmol/L乙酸钠)=20∶80 时，样品可以获得较好的分离，且峰形和重现性均较好。

　　3.3 检测器参数的设定

　　吲哚乙酸([1]NHCh3COOH)和吲哚丙酸([1]NHCh3Ch3COOH)均具有吲哚环骨架结构特征。荧光检测器和紫外检测器皆可用于其分析，但因其在植物体内含量极低，加之紫外检测器灵敏度低，故本研究选用荧光检测器进行检测。采用荧光检测器的波长自扫描功能，得到吲哚乙酸的激发波长和发射波长分别为275和345 nm。吲哚丙酸的激发波长和发射波长分别为280和350 nm。因吲哚乙酸含量远低于吲哚丙酸，故最终确定选用吲哚乙酸的激发波长275 nm和发射波长345 nm作为检测波长。

　　3.4 回归方程、相关系数及线性范围

　　以植物激素标准溶液为原液，以80%甲醇稀释得到一系列浓度标准溶液，在上述色谱条件下进行分析。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算回归方程及相关系数。配制3.5和5.0 μg/L的IAA和IPA标准溶液，分别连续进样6次，计算峰面积相对标准偏差。通过对IAA和IPA的标准品储备液进行稀释，采用3倍信噪比(S/N)计算检出限，结果见表1。标准品色谱图见图1。表1 吲哚乙酸和吲哚丙酸的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和精密度

　　3.5 加标回收率实验

　　精确称取IAA和IPA含量已知的拟南芥样品，分别加入0.1，0.2和0.3 ng IAA及6.7，8.3和12.4 ng IPA的对照品，每一个浓度水平重复3次。结果吲哚乙酸的平均回收率为103.8%，吲哚丙酸的平均回收率为102.6%。

　　3.6 样品测定

　　将处理好的拟南芥样品，按上述的色谱条件进行测定，吲哚乙酸和吲哚丙酸的平均含量分别为62.24 pg/mg和8.13 ng/mg(样品色谱图见图2)。 图2 250 mg拟南芥样品色谱图

　　Fig.2 HPLCFLD chromatogram of extract from 250 mg Arabidopsis thaliana

　　本实验建立了拟南芥少量样品(&<300 mg)中超微量含量植物生长素的提取和检测方法，与文献[12]报道植物生长素的含量一致。吲哚乙酸一直是植物激素的研究重点，其在植物体内的合成、运输和分布水平均直接影响植物的生长发育;因为其超低含量难以精确测定，严重制约了与生长素相关的植物生理学研究的深入。GCMS是研究IAA使用最广泛的分析仪器，但样品处理要经过繁琐的纯化和衍生过程[13，14]，处理过程中样品损失量很大，不利于建立高通量的生长素测定方法。寻找一种快速、灵敏度高，成本低的方法，以期能在短时间内处理多个样品非常必要。与传统的GCMS定量分析方法相比[15，16]，本方法所需植物组织的量较少，处理方法简单，减少了劳力和时间的消耗，可以应用于新鲜拟南芥植物材料中IAA和IPA两种生长素的定量分析，灵敏准确，达到与质谱相近的灵敏度[17]，可以在大多数生物和化学实验室使用。

　　致 谢 本实验植物材料由中国科学院遗传与发育生物学研究所王冰提供，谨致谢忱!

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