作者：程容，成映霞，段永强，王道坤，朱立鸣，梁玉杰
【摘要】 目的 探讨敦煌石室大宝胶囊对亚急性衰老大鼠脑功能的保护效应及作用机制。方法 除空白对照组外，采用D-半乳糖建立大鼠衰老模型并随机分为模型组、阳性药物组及敦煌石室大宝胶囊大、中、小剂量组，经药物干预后，测定各组大鼠脑组织去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的表达水平和Ca2+含量。结果 与空白对照组比较，模型组大鼠脑组织内NE、DA、5-HT含量明显降低(P&<0.05)，Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性显著降低(P&<0.01，P&<0.05，P&<0.01)，Ca2+含量显著升高(P&<0.05);应用受试药物治疗后，大鼠脑组织内NE、DA、5-HT含量显著增高(P&<0.05)，Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性显著增高(P&<0.05或P&<0.01)，Ca2+含量显著降低(P&<0.05)。结论 敦煌石室大宝胶囊具有促进衰老大鼠脑组织单胺类神经递质表达以及调节脑组织钙稳态的作用，对老化大脑的功能有一定改善作用。
【关键词】 单胺类神经递质;钙稳态;亚急性衰老模型;敦煌石室大宝胶囊
Abstract：Objective To study the protective function and its mechanism of Dunhuang Shishi Dabao Capsule (DHDB) on brain function of sub-acutely aging rats. Methods Except normal group， the subacutely aging model rats were made by injecting D-gal into abdominal cavity continually and pided into 5 groups randomly：model group， positive control group and high， middle， low dose of DHDB group. After treated with corresponding drugs， cerebral cortex NE， DA， 5-HT， Na+-K+-ATPase， Ca2+-ATPase， Ca2+-Mg2+-ATPase and Ca2+ levels were detected. Results NE， DA， 5-HT， Na+-K+-ATPase， Ca2+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase levels in model group were significantly downregulated compared with normal group (P&<0.05)， Ca2+ level was increased significantly (P&<0.05). After treated with DHDB， NE， DA， 5-HT， Na+-K+-ATPase， Ca2+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase levels were significantly upregulated (P&<0.05)， Ca2+ level was reduced significantly (P&<0.05). Conclusions DHDB can upregulate monoamine neurotransmitter levels and regulate calcium homeostasis in the brain tissue of aging model rats， and play an important role in improving the aging cerebral function.
Key words：monoamine neurotransmitter;calcium homeostasis;subacutely aging model;Dunhuang Shishi Dabao Capsule
现代医学证明，衰老是机体细胞、组织、器官和系统结构功能增龄性衰退的过程，其中神经递质含量变化是神经系统衰老的主要指标之一[1];同时，衰老钙假说认为，细胞内钙超载或钙稳态失调可能是细胞损伤、衰老、死亡的最后的共同途径[2]。敦煌石室大宝胶囊由熟地黄、黄芪、当归、茯苓、大黄等药物组成，具有强肾填精、健脾益气、涤痰祛瘀、安和五脏的功效。已有研究结果表明，敦煌石室大宝胶囊能够降低脑组织单胺氧化酶-B(MAO-B)活性，提高谷胱甘肽过氧化物本系酶(GSH-Px)、钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase)活性，具有调节脑细胞能量代谢、保护脑功能的作用[3-4]。为进一步探讨敦煌石室大宝胶囊对亚急性衰老大鼠脑功能的保护效应及作用机制，本研究观察了该制剂对亚急性衰老模型大鼠脑组织单胺类神经递质表达水平及钙平衡的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，3月龄，体重(180±20)g，甘肃中医学院医学实验中心提供，合格证号：SCXK(甘)2004- 0006-0000201;SPF级实验设施合格证：SYXK(甘)2004-006- 000092。
1.2 药物、试剂与仪器
敦煌石室大宝胶囊(本院院内制剂);桂附地黄丸，兰州佛慈制药厂生产(批号20040925);去甲肾上腺素(NE)测试盒，批号RT110371;多巴胺(DA)测试盒，批号RT110371;5-羟色胺(5-HT)测试盒，批号RT110371;Na+-K+-ATPase测试盒，批号20071113; Ca2+-Mg2+-ATPase测试盒，批号20071113;钙ATP酶 Ca2+-ATPase测试盒，批号20071113;钙离子(Ca2+)测试盒，批号20071113，以上测试盒均购自南京建成生物工程研究所。722型分光光度(06-2-87)计(北京瑞利分析仪器公司);快速混匀器(XK96-A);数显恒温水浴锅(郑州杜甫仪器厂);酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD);快速混匀器(XK96-A)。
1.3 分组、造模与给药
用随机数字表法[5]分为空白对照组、模型组、桂附地黄丸组(阳性对照组)，以及DHDB大、中、小剂量组，每组8只，雌雄各半，分笼饲养。参照文献[6]方法，空白对照组每日皮下注射等量生理盐水，其余各组受试动物颈部皮下注射D-半乳糖0.125 g/kg，每日1次，连续40 d。空白对照组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃;DHDB大、中、小剂量组分别予0.8、0.4、0.16 g/(kg?d)敦煌石室大宝胶囊药剂灌胃，等效剂量按人与动物体型系数折算[7](相当于成人剂量的10、5、2倍);阳性对照组给予0.4 g/(kg?d)桂附地黄丸灌胃(相当于成人剂量的5倍)。各组均以蒸馏水、标准饲料喂养。连续灌胃40 d。
1.4 标本制备
各组动物最后1次灌胃，禁食不禁水24 h后全部杀检。脑组织匀浆制备：采血后断头处死，低温条件下快速取脑组织，以冰冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后置于匀浆器中用9倍生理盐水匀浆(匀浆器的末端置于放冰块的冷水中)，以3 500 r/min离心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存待测。
1.5 指标检测
常规组织匀浆后，离心分离上清，NE、DA、5-HT采用放免法测定;Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase、Ca2+采用比色法测定，具体操作按测试盒说明书进行。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0软件统计，实验数据以±s表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD分析，方差不齐时用Dunnett’s方法分析。
2 结果
(见表1)表1 各组大鼠脑组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase活性及Ca2+、NE、DA、5-HT含量比较
3 讨论
中枢单胺能神经系统作为最重要的中枢递质系统，其增龄性退行性改变在衰老和脑老化过程中的重要性日益受到重视。由于增龄性神经元树突、轴突、突触的退变，神经细胞的丢失，必然引起作为介质发挥生物学效应的神经递质的增龄性改变[8-9]。单胺类神经递质包括DA、NE和5-HT等，具有广泛的生物学效应。研究表明，脑内DA系统与躯体运动、行为、觉醒、情感等的调节有关，表现为整体行为兴奋作用，并参与记忆痕的再现[10]。NE能神经元参与调整整个大脑皮层兴奋状态，对觉醒、感觉、情绪和高级认知功能产生广泛的影响。5-HT与精神活动、感觉体温调节、高级认知功能有关。但随着年龄的增加，DA、NE、5-HT等神经递质的活性和转换率有不同程度的降低，出现学习、记忆、运动、感觉、情绪、睡眠等障碍。单胺类神经递质的含量及活性降低，特别是NE活性降低能引起与年龄相关的记忆力减退。
D-半乳糖诱发动物衰老与氧化应激损伤、自由基毒性有关。蓄积的自由基也会引起脑神经细胞膜脂质过氧化损伤，而影响膜通透性及离子转运，触发Ca2+内流而组织细胞钙稳态失调[11]。而细胞内钙超载可能是细胞损伤、衰老、死亡的最后的共同途径。研究表明，随着年龄的增长，体内多种酶活性下降，细胞内Ca2+浓度升高，引起Ca2+超载，导致钙稳态失调，最终使细胞死亡。其主要机制为衰老过程中机体抗氧化能力减弱，导致自由基大量堆积，一方面损伤生物膜，使膜对Ca2+通透性增大，另一方面，Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低，细胞外排Ca2+的能力减弱，最终导致脑神经细胞损伤，表现学习记忆障碍，形成衰老样的行为学和生化学方面的改变[12-13]。
现代药理研究表明，熟地黄、黄芪、当归等药物有效成分均对神经系统功能具有调节作用[14-16]。本实验结果显示，衰老模型组大鼠脑内的单胺类神经递质NE、DA、5-HT计数水平下降，提示大鼠脑内单胺类递质水平存在明显的增龄衰老性变化，其递质含量以下降为主。而与衰老模型组比较，DHDB组大鼠脑内单胺类神经递质含量显著升高，说明敦煌石室大宝胶囊能提高衰老模型大鼠大脑皮质单胺类神经递质含量，使作为神经元之间信息传递媒介的神经递质含量趋于正常，改善大脑皮层兴奋性，发挥其正常生物学效应，调节各组织器官功能，适应内外环境变化，从而保护大脑功能。并且衰老模型大鼠脑组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性下降，脑组织内Ca2+含量上升。说明衰老过程中，由于维持钙稳态的调节机制被破坏，导致细胞内Ca2+浓度升高，钙稳态失调。敦煌石室大宝胶囊可显著提高衰老模型大鼠脑组织Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性，降低脑组织中Ca2+的浓度，从而改善D-半乳糖引起的氧化应激损伤，并降低脑神经细胞内Ca2+含量，阻止D-半乳糖引起氧化应激-Ca2+超载-氧化应激的恶性循环。故敦煌石室大宝胶囊具有促进衰老大鼠脑组织单胺类神经递质表达水平以及调节脑组织钙稳态的作用，对老化大脑的功能有一定改善作用。
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现代药理研究表明，熟地黄、黄芪、当归等药物有效成分均对神经系统功能具有调节作用[14-16]。本实验结果显示，衰老模型组大鼠脑内的单胺类神经递质NE、DA、5-HT计数水平下降，提示大鼠脑内单胺类递质水平存在明显的增龄衰老性变化，其递质含量以下降为主。而与衰老模型组比较，DHDB组大鼠脑内单胺类神经递质含量显著升高，说明敦煌石室大宝胶囊能提高衰老模型大鼠大脑皮质单胺类神经递质含量，使作为神经元之间信息传递媒介的神经递质含量趋于正常，改善大脑皮层兴奋性，发挥其正常生物学效应，调节各组织器官功能，适应内外环境变化，从而保护大脑功能。并且衰老模型大鼠脑组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性下降，脑组织内Ca2+含量上升。说明衰老过程中，由于维持钙稳态的调节机制被破坏，导致细胞内Ca2+浓度升高，钙稳态失调。敦煌石室大宝胶囊可显著提高衰老模型大鼠脑组织Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性，降低脑组织中Ca2+的浓度，从而改善D-半乳糖引起的氧化应激损伤，并降低脑神经细胞内Ca2+含量，阻止D-半乳糖引起氧化应激-Ca2+超载-氧化应激的恶性循环。故敦煌石室大宝胶囊具有促进衰老大鼠脑组织单胺类神经递质表达水平以及调节脑组织钙稳态的作用，对老化大脑的功能有一定改善作用。
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