作者：张秋雁1，王权礼1，苏剑峰1，邓冰湘1，蔡光先1，李雅
【摘要】 目的 探讨血府逐瘀汤对急性心肌缺血大鼠缺血心肌血管新生的影响及其分子学机制。方法 雄性SD大鼠，结扎冠状动脉左前降支复制急性心肌缺血模型，随机分为模型组、血府逐瘀汤组、麝香保心丸组，并设假手术组。造模后24 h各组灌胃给予相应药物或蒸馏水，每日1次，连续7 d，于第7日灌胃后1 h断头处死动物，取出心脏。用免疫组化法测定缺血心肌内皮细胞数和微血管密度，检测缺血心肌局部血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达。结果 血府逐瘀汤组内皮细胞数、微血管密度及VEGF表达均明显升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 血府逐瘀汤能够促进心肌缺血大鼠缺血心肌血管新生，对缺血心肌具有保护作用，其作用机制可能与上调心肌局部VEGF蛋白表达有关。
【关键词】 血府逐瘀汤；急性心肌缺血；血管新生；血管内皮细胞生长因子；大鼠
Abstract：Objective To explore the protective effects of Xuefu Zhuyu Decoction of myocardial angiogenesis and molecular mechanisms rats with acute myocardial ischemia. Methods The left anterior descending coronary artery was ligated to make the model of myocardial ischemia in SD rats. The rats were pided into 4 groups at random：the model group， Shexiangbaoxin pills group， Xuefu Zhuyu Decoction group and the sham operation group， with 8 rats in each group. All groups were treated for 7 days by corresponding drug. After 7 days， all rats were killed and the hearts were taken for detecting cardiac endothelial cell and the microvessel vascular density (MVD). The expression of VEGF at protein level was studied by immuneohistochemical method. Results Compared with model group， Xuefu Zhuyu Decoction could significantly enhance the levels of MVD and expression of VEGF (P＜0.05). Conclusion Xuefu Zhuyu Decoction can promote angiogenesis in ischemic myocardium of rats. It has protective effect on acute myocardial ischemia in rats. Upregulating the expression of VEGF may be one of its mechanisms.
Key words：Xuefu Zhuyu Decoction；acute myocardial ischemia；angiogenesis；VEGF；rats
有研究表明，血府逐瘀汤可以明显减轻急性心肌缺血模型大鼠血清和心肌组织脂质过氧化损伤，有效减少缺血心肌酶的外漏；通过调节相关因子的蛋白表达，抑制缺血心肌细胞凋亡及坏死；明显提高心肌缺血大鼠血浆一氧化氮水平，降低内皮素含量，保护血管内皮细胞；改善血瘀模型大鼠的血液流变性[1-3]。本实验旨在探讨血府逐瘀汤对急性心肌缺血大鼠缺血心肌血管新生及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的影响，现报道如下。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级SD大鼠，雄性，体重为(200±50)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2009- 0004。
1.2 药物
血府逐瘀汤处方组成：桃仁、红花、当归、生地黄、川芎、赤芍、牛膝、柴胡、桔梗、枳壳、甘草等，保持《医林改错》原方的剂量比例不变，由湖南省中药超微工程技术研究中心提供。麝香保心丸，由上海和黄药业有限公司生产，批号090208。
1.3 仪器
DH-140动物人工呼吸机，浙江医科大学医疗仪器实验厂生产；四道生理记录仪(包括RM6280多导生物信号处理系统)，成都仪器厂生产；HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅，上海南阳仪器有限公司生产；LEICA DM LB2型双目显微镜，德国LEICA公司生产；Haier医用微波炉，Haier集团生产；MIAS医学图像分析系统，北航公司生产；S2-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂生产；Shandon325型石蜡切片机，英国Shandon公司生产；DNP-9162型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司生产；Motic B5显微摄像系统，麦克奥迪实业集团公司生产。
1.4 试剂
CD34兔源性多克隆抗体，批号BA0532；DAB显色试剂盒，批号AR1021；VEGF兔源性多克隆抗体，批号BA0407；即用型SABC免疫组化染色试剂盒，批号SA1022。以上试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[4]方法，腹腔注射20%乌拉坦(0.5 mL/100 g)麻醉大鼠，固定，连接四道生理记录仪。行气管插管术，连接动物呼吸机。沿胸骨正中线左侧旁开1～2 mm处切开皮肤，暴露肋骨，从第4、5肋骨间剪开，轻轻插入开胸器，暴露心脏，用止血钳将心包膜前部轻轻剥开，然后用止血钳将左心耳轻轻提起，再用持针器持无创性小圆弯针在左冠状动脉前降支根部穿一根零号医用缝合线结扎血管。以心电图ST段的改变及左室前壁向外膨胀发绀为结扎成功标志。术后腹腔注射青霉素8万U/只×3 d，抗感染。
2.2 分组与给药
成活大鼠随机分为模型组、血府逐瘀汤组、麝香保心丸组，并设假手术组，每组8只。造模后24 h灌胃给药，每日1次，给药剂量10 mL/kg，连续7 d。假手术组及模型组灌胃蒸馏水；血府逐瘀汤组灌胃血府逐瘀汤13.68 g/(kg?d)；麝香保心丸组灌胃麝香保心丸悬溶液0.03 g/(kg?d)。于第7日灌胃后1 h麻醉大鼠后断头处死。
2.3 缺血心肌内皮细胞数和微血管密度的测定
应用免疫组织化学法对各组大鼠缺血心肌组织中CD34进行测定，阳性点在光学显微镜呈黄色至棕褐色。操作按试剂盒说明书进行。用CD34多克隆抗体免疫组化染色后，血管内皮细胞被染成棕黄色。用Motic B5显微摄像系统400倍光镜视野下在心肌梗死边缘区随机选取5个视野，用MIAS医学图像分析系统分析计数内皮细胞，同时计数微血管，以5个视野的平均值为该份标本的内皮细胞数和微血管数(MVC)，以MVC/mm2表示微血管密度(MVD)。
2.4 心肌梗死边缘区血管内皮细胞生长因子免疫组化检测采用免疫组织化学法检测VEGF在缺血心肌中的蛋白表达情况。操作步骤、阳性结果判断见“2.3”项。其中VEGF一抗稀释倍数为1∶100。通过Motic B5显微摄像系统采集图像，用MIAS医学图像分析系统进行计算机图像分析，每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，取每个视野“阳性区平均光密度”的均数作为该份标本的光密度值(MOD)。
3 统计学方法
全部数据均用—x±s表示，组间比较采用方差分析，采用SPSS16.0统计软件进行处理。
4 结果(见表1)
表1 各组大鼠缺血心肌内皮细胞数、MVD和MOD值比较(—x±s)
组别 只数 内皮细胞数
(个/视野) MVD
(n/mm2) MOD
假手术组 8 72.62±16.59 6.37±1.45 0.14±0.03
模型组 8 100.88±21.34★ 8.85±1.87★ 0.19±0.05★
血府逐瘀汤组 8 130.12±28.08▲★★ 11.42±2.46▲★★ 0.26±0.06▲★★
麝香保心丸组 8 128.88±31.08▲★★ 11.31±2.73▲★★ 0.25±0.06▲★★
注：与模型组比较，▲P＜0.05；与假手术组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01
5 讨论
血府逐瘀汤系清代名医王清任的活血化瘀之代表方，临床广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗死等疾病的防治，效果较佳。本实验应用冠状动脉结扎造成大鼠急性心肌缺血模型，观察缺血心肌血管新生和VEGF蛋白表达的变化。心肌缺血、缺氧后血管新生被激活，新生血管能减轻心肌缺血、减少细胞坏死、预防和逆转左室重构、改善患者的临床症状，但这种自发形成的微血管不能充分代偿冠状动脉阻塞造成的血流损失。本实验采用抗体CD34来标记大鼠心肌梗死边缘区切片中血管内皮细胞的表达状况，以反映血管新生情况，并测定、分析、比较其内皮细胞数和MVD。在研究血管新生的指标中，MVD是反映血管新生强度的半定量指标，现已被很多实验用于作为检测血管新生的指标[5]。心肌缺血时的血管新生均是由生长因子起作用的，其中VEGF是目前公认的最重要的促血管新生因子之一。VEGF主要作用是特异性地促进内皮细胞有丝分裂和增强血管通透性，故其又称为血管通透性因子。VEGF对血管内皮细胞的特异性促有丝分裂作用与其促血管新生作用有密切联系。VEGF在正常组织中有少量表达，当心肌缺血缺氧时，心肌内VEGF的表达量明显增加[6]。本实验发现，血府逐瘀汤能显著增加心肌梗死边缘区内皮细胞数和微血管数目，明显促进心肌缺血后大鼠缺血心肌血管新生，其作用机制可能与其上调VEGF的蛋白表达有关。
参考文献
[1] 张秋雁，苏剑峰，周小青，等.血府逐瘀汤抗心肌缺血的实验研究[J].中医研究，2004，17(5)：20－21.
[2] 张秋雁，苏剑峰，周小青，等.桃仁-红花“药对”不同配比的血府逐瘀汤对急性心肌缺血的保护作用[J].中国中医药信息杂志，2005，12(5)：29－30.
[3] 邓冰湘，谭达全，张秋雁，等.血府逐瘀汤对大鼠急性心肌缺血心电图及瘀血模型血液流变性的影响[J].中医研究，2005，18(1)：17－19.
[4] 徐叔云，亢如濂，陈修，等.药理实验方法学[M].2版，北京：人民卫生出版社，1994：921.
[5] Zhang Sanyin， Chen Shilin， Shen Yingjun， et al. Puerarin induces angiogenesis in myocardium of rat with myocardial infarction[J]. Biol Pharm Bull，2006，29(5)：945－950.
[6] Banai S， Shweiki D， Pinson A， et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia：implications for coronary angiogenesis[J]. Cardiovasc Res，1994，28(8)：1176－1179.