【摘要】 目的 优选丹蛭降糖胶囊的最佳提取工艺。方法 采用直接水蒸气蒸馏法提取出牡丹皮中丹皮酚成分，再将其药渣与其他药味混合，选择三因素三水平正交试验，以出膏率、多糖、芍药苷含量为考察指标，对提取次数、提取时间、加水量进行考察。结果 确定的最佳提取工艺为：加10倍量水提取3次，每次1.5 h。结论 此工艺可作为丹蛭降糖胶囊的提取工艺，方法简便，结果稳定。
【关键词】 丹蛭降糖胶囊；提取工艺；正交设计
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2011.02.022
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2011)02-0055-03
Optimization of Extracting Process of Danzhi Jiangtang Capsule JIANG Lei1，2， WANG Yong-zhong2， HAN Yan-quan2 (1.Anhui College of TCM， Hefei 230031， China；2.The First Affiliated Hospital of Anhui College of TCM， Grade 3 Laboratory of TCM Preparation， State Administration of TCM， Hefei 230031， China)
Abstract：Objective To optimize the extracting condition for Danzhi Jiangtang Capsule. Methods With the wet distillation to extract the paeonol in moutan cortex， then admix its gruffs and other medicinal substances， orthogonal design with three factors and three levels was used and taking the rate of paste， amont of polycose and the content of paeoniflorin as the standards to study the extracting frequency， times and amount of water. Results The optimized extracting condition was to add water with 10 folds， extract for 1.5 hour and extract 3 times. Conclusion The optimized process is convenient and stable.
Key words：Danzhi Jiangtang Capsule；extracting process；orthogonal design
丹蛭降糖胶囊(院内制剂)由牡丹皮、地黄、泽泻、太子参、菟丝子等药组成，主治2型糖尿病之气虚阴亏血瘀证及其慢性并发血管病变。该制剂已有近十年的临床使用经验，对平稳控制血糖、改善脂代谢紊乱、改善血液流变性、改善微循环、抗氧化、清除氧自由基、抗炎、抗血小板聚集、保护血管内皮功能方面均有良好的疗效，其多途径、多靶点的作用特点对糖尿病及其血管病变起到了综合治疗作用[1-2]。在前期药理毒理研究及临床研究基础上，本试验根据各药味的特性，对其提取工艺进行优化，以便更好地应用于临床。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(600泵，2487检器，Millennium32工作站)；Agilent-8453紫外分光光度计；电子天平(友声衡器有限公司)；医用离心机(上海手术器械厂)；水浴锅；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；真空干燥箱(巩义市英峪予华仪器厂)。无水葡萄糖对照品(中国医药集团上海化学试剂公司，批号20090514)；芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110736-200934)。浓硫酸；苯酚；甲醇为色谱纯；水为双蒸水。
2 方法与结果
2.1 干膏得率的计算
将正交试验所得各组提取液均浓缩至500 mL，分别取100 mL至蒸发皿中，100 ℃水浴蒸干，于80 ℃常压干燥至恒重，移至干燥器中冷却30 min，迅速称重，计算干膏得率。干膏得率(%)＝干膏重量/原药材的重量×100%。
2.2 干膏中总多糖的含量测定[3]
2.2.1 标准曲线的制备 称取经105 ℃烘干至恒重的葡萄糖对照品75 mg，用蒸馏水定容至250 mL，得对照品溶液。分别取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置50 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。分别取上述溶液2.0 mL于15 mL具塞试管中，各试管分别加1.0 mL 5%苯酚溶液，混匀，迅速滴加5.0 mL浓硫酸，振摇5 min，置沸水浴中加热15 min，放冷水中冷却。另取2.0 mL蒸馏水同上法制成空白对照溶液，于490 nm处测定其吸光度值。以吸光度(A)对葡萄糖浓度(C)作线性回归，得回归方程为A＝12.242C＋0.144 4，r＝0.999 1，表明葡萄糖标准溶液在0.006～0.036 mg/mL范围内线性关系良好。
2.2.2 样品溶液的制备 各取样品0.5 g，用蒸馏水定容至50 mL，沸水浴30 min，趁热用脱脂棉过滤，待冷却后取1 mL，加无水乙醇至10 mL，搅拌，离心，弃上清液，沉淀用无水乙醇洗涤至无色，挥干乙醇，沉淀用蒸馏水定容至100 mL，得样品溶液，进行含量测定。多糖含量(mg/g)＝A样品/A对照品×葡萄糖对照品浓度×稀释倍数。
2.3 干膏中芍药苷含量的测定[4]
2.3.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相：甲醇-水(35∶65)，流速0.9 mL/min，检测波长为230 nm。2.3.2 标准曲线的制备 精密称取芍药苷标准品0.47 mg，用甲醇定容至5 mL，精密量取芍药苷对照品4、8、12、16、20 μL进样，测定峰面积。以峰面积积分值(A)对浓度(C)进行回归分析，得回归方程为：A＝822 796C－59 211，r＝0.999 8，表明芍药苷对照品在0.376～1.88 mg/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.3.3 样品溶液的制备 称取各组干浸膏0.1 g，用甲醇定容至10 mL，称定重量，超声30 min，放冷，补足甲醇减失的重量，过滤，进行含量测定。芍药苷含量(mg/g)＝样品峰面积/对照品峰面积×对照品浓度×稀释倍数。
2.4 正交试验
2.4.1 试验设计 先将牡丹皮加20倍水，浸泡，进行直接水蒸气蒸馏，收集馏分至不再浑浊，冷藏24 h，抽滤得丹皮酚晶体，滤液再加适量5%NaCl重蒸馏，收集浑浊滤液，冷藏，抽滤，得丹皮酚晶体。药渣与其他药味混合进行提取条件的优化。以提取次数、提取时间、加水量为考察因素，每个因素在预试验的基础上设3个水平，选用L9(34)正交表安排实验，优选提取工艺。见表1。
表1 提取因素水平表
水平 提取次数(次) 提取时间(h) 加水量(倍)
A B C
1 1 1.0 8
2 2 1.5 10
3 3 2.0 12
2.4.2 结果与分析 结果分析表明，以芍药苷含量为考察指标，提取次数(A)、提取时间(B)、加水量(C)对其无显著影响，从直观分析可以看出，3个因素的影响主次是A＞C＞B。以出膏率为指标时，直观分析显示各因素作用主次为A＞C＞B，其中A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，方差分析显示，A因素对结果有显著影响，B、C因素无显著影响，可确定最佳提取工艺为A3B2C2。以多糖为指标时，直观分析表明，各因素作用主次也为A＞C＞B，其中A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，但B2与B3非常接近，从节约资源和试验方便性角度考虑可选用B2，即提取1.5 h即可，所以，最佳提取工艺也为A3B2C2，与以出膏率为指标优选的条件相符。正交试验结果见表2，方差分析见表3～表5。
表2 正交试验结果
试验号 A B C 出膏率
(%) 多糖量
(g) 芍药苷含
量(mg/g)
1 1 1 1 21.17 2.22 2.11
2 1 2 2 26.58 2.64 2.56
3 1 3 3 28.15 3.31 2.56
4 2 1 2 32.22 5.46 2.62
续表2
试验号 A B C 出膏率
(%) 多糖量
(g) 芍药苷含
量(mg/g)
5 2 2 3 32.89 4.67 2.44
6 2 3 1 28.60 3.55 2.60
7 3 1 3 35.81 6.37 2.67
8 3 2 1 38.47 7.32 2.61
9 3 3 2 39.41 8.00 2.35
浸
膏 K1 25.300 29.733 29.413
K2 31.237 32.647 32.737
K3 37.897 32.053 32.283
R 12.597 2.914 3.324
多
糖 K1 2.723 4.483 4.363
K2 4.560 4.877 4.187
K3 7.230 4.953 5.363
R 4.507 0.270 1.004
芍
药
苷 K1 2.410 2.467 2.440
K2 2.553 2.537 2.510
K3 2.543 2.503 2.557
R 0.143 0.070 0.117
表3 出膏率统计结果
误差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性
A 238.276 2 119.138 22.198 P＜0.05
B 14.222 2 7.111 1.325
C 19.487 2 9.744 1.815
D 10.730 2 5.365
表4 多糖量统计结果
误差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性
A 30.821 2 15.406 265.612 P＜0.01
B 0.116 2 0.058 1.000
C 1.523 2 0.761 5 13.129
D 1.120 2 0.06
表5 芍药苷含量统计结果
误差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性
A 0.038 2 0.019 0 5.429
B 0.007 2 0.003 5 1.000
C 0.021 2 0.010 5 3.000
D 0.010 2 0.005 0
注：FO.05(2.2)＝19，FO.01(2.2)＝99
2.5 验证试验
为进一步考察优选工艺的稳定性，按照优选出的最佳工艺进行3次验证试验，结果表明优选的条件可靠、稳定(见表6)。
表6 验证试验结果
试验号 出膏率(%) 多糖量(g) 芍药苷含量(mg/g) 芍药苷转移率(%)
1 38.34 7.966 2.55 63.17
2 38.18 7.848 2.54 63.15
3 38.32 7.888 2.57 63.83
3 讨论
原制剂工艺中将牡丹皮与其他药味一同煎煮，丹皮酚损失量大，利用高效液相色谱测定对制剂中丹皮酚的含量进行测定， 发现其含量极低，且利用薄层鉴别几乎鉴别不出。本试验将牡丹皮单独提取，提取率最高可达90%，减少了方中有效成分的流失，制剂质量得以提高。药理研究表明，丹皮酚药理活性广泛，主要用于心脑血管、肿瘤、炎症、变态反应及免疫系统疾病[5]。研究发现，丹皮酚可以通过降低糖尿病大鼠血中的内皮素、血栓素B2、C反应蛋白、细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1含量，升高6-酮-前列腺素F1α的含量，达到保护糖尿病大鼠血管内皮细胞的作用[6]。
本试验采用苯酚-硫酸显色法，以葡萄糖计算测定复方中药提取液中总多糖的含量。由于多糖不溶于乙醇，故采用乙醇沉淀提取多糖，经预试验考察，采用无水乙醇进行沉淀效果最佳，所以，本试验采取在1 mL样品溶液中加无水乙醇至10 mL的方法进行处理。另外，硫酸加入的量和水浴时间也需严格控制，硫酸加入后要充分混匀，100 ℃水浴30 min。
在正交设计选用芍药苷为指标时，提取的次数、时间、加水量对其均无显著影响，原因可能是芍药苷水提取较易提出，且芍药苷也是牡丹皮的主要成分之一，将牡丹皮单提时已将芍药苷提出一部分，正交试验设定的因素水平已达到了其提取的最大提取率。但对芍药苷含量的直观分析可以看出，3个因素的影响主次是A＞C＞B，和对出膏率、多糖量的直观分析一致。
本研究确定了丹蛭降糖胶囊提取的最佳工艺，优选后的最佳工艺条件为A3B2C2，即加10倍量水提取3次，每次1.5 h。通过验证试验证明其最佳工艺稳定、可靠。
参考文献
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[2] 舒仪琼，方朝辉，鲍陶陶.丹蛭降糖胶囊治疗2型糖尿病临床观察[J].中国中医急症，2007，16(2)：158－159.
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[4] 齐伟，邬丽红，郑东明.HPLC法测定妇康宝口服液中芍药苷的含量[J].武警医学院学报，2009，18(5)：437－438.
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