作者：齐文杰，张淑文，王红，张苗苗，文艳，王宝恩
【摘要】 目的 通过制作急性重症胰腺炎大鼠模型，探索急性热性病湿热证动物模型。方法 采用5%的牛磺胆酸钠逆行胆胰管注入制作大鼠急性重症胰腺炎模型。观察造模后动物体重、体温、精神、大便、舌苔等，以舌苔厚腻作为评价动物模型湿热证存在的指标。大鼠随机分为模型组、假手术对照组、正常组。造模成功后模型组再根据舌苔是否厚腻分为舌苔厚腻组(A组)和舌苔正常组(B组)。进行血淀粉酶、内毒素、肿瘤坏死因子(TNF)测定及胰腺病理学分析。结果 急性重症胰腺炎大鼠造模后出现倦怠、体重下降(P&<0.05)、便溏、舌苔厚腻(出现频率42.6%)、内毒素及TNF水平升高，与假手术组及正常组比较，P&<0.05，体温升高不明显。结论 急性重症胰腺炎大鼠模型是一个更符合临床急性热性病湿热证发病过程的动物模型，为湿热证的证型实质探讨提供了较为理想的动物模型。
【关键词】 动物模型;大鼠;湿热证;胰腺炎
Abstract：Objective To explore animal modeling of acute fever disease with damp-heat syndrome by using rat models of severe acute pancreatitis (SAP). Method SAP was induced by retrograde injection into the biliopancreatic duct of 5% sodium taurocholate. The body weight， temperature， mental status， stools， fur of tongue， etc. were observed after model made. A white or yellow and greasy tongue coating was considered as a marker to evaluate damp-heat syndrome of the animal model. Rats were pided into three groups randomly：SAP group， sham operated (SO) group and control (C) group. SAP group was pided further into A group (damp-heat syndrome group which a white or yellow and greasy tongue coating existed) and B group (normal tongue coating). The level of serum amylase， endotoxin， TNF and the pathological lesion scores of pancreas tissue were analyzed. Results Lassitude， body weight loss (P&<0.05)， loose stools and a white or yellow and greasy tongue coating (frequency of occurrence is 42.6%) were noted in parts of rat models. The level of plasma endotoxin and serum TNF were obviously increased (vs the group of SO and C， P&<0.05). Body temperature of rat models were not significantly changed. Conclusion The SAP rat model can be considered as a good animal model in accordance with acute fever disease with damp-heat syndrome， which supplies a relative ideal animal model for
exploring the pathogenesis of damp-heat syndrome.
Key words：animal model;rats;damp-heat syndrome;pancreatitis
湿热证是中医急性热性病中具有特殊规律的一类征候群。临床上许多急性感染性疾病患者在发病过程中表现湿热证候， 予以西医常规抗感染综合治疗效果不理想，病情缠绵难愈，其病机及临床研究已成为近年的热点。借鉴现代医学研究成果，模拟中医热性病湿热证发病机制，建立理想动物模型，亦是揭示热性病湿热证本质的关键环节。目前，国内有关湿热证的动物模型多根据中医学关于湿热的成因来模拟建立，采用综合因素造模，即高温、高湿环境及高脂饮食，加上病原微生物感染。但临床常见急性感染性疾病患者，在起病急骤、病程很短的情况下即可出现舌苔厚腻的“湿”象，并没有高温、高湿的外在因素 影响。对于此类急性热性病湿热证证型实质的研究，目前并没有与病情发展相符合的动物模型可供借鉴。急性重症胰腺炎(SAP)患者病情发展过程中常见湿热证，故本研究采用SAP来建立一个与临床急性热性病湿热证相符合的动物模型，根据证象(主要是舌苔厚腻)判断湿热证的有无，从而建立湿热证的动物模型。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，体重为(200±50)g，动物许可证编号：SCXK-(军)-2007-004。
1.2 分组
实验前观察大鼠舌苔情况，大鼠正常舌苔为白色，在舌体中部居中处可见。入选大鼠共计190只。随机分为模型组(SAP组)130只[按文中所述方法制作SAP模型后，根据舌苔情况，再分为舌苔厚腻组(A组)、舌苔正常组(B组)]、假手术对照组(SO组)50只、正常对照组(C组)10只。在实验过程中因麻醉意外及病情发展等原因死亡的大鼠相关数据不作统计。
1.3 模型制备
实验前每只大鼠称体重及测量体温，观察精神、毛色、大便及舌质、舌苔情况，术前禁食12 h，正常饮水。SAP组：采用胆胰管逆行匀速注入5%牛磺胆酸钠(0.1 mL/100 g，购自美国Amresco公司)方法制作模型[1]。步骤如下：2%戊巴比妥钠(50 mg/kg，购自德国Merck公司)腹腔内注射麻醉，沿正中线剑突下逐层切开腹壁进入腹腔，于十二指肠内侧见片状分布的胰腺，找到胆胰管，肝门部胆胰管用无损伤动脉夹夹闭，从胆胰管开口十二指肠系膜缘对侧肠壁穿刺插入4号静脉穿刺针头，进入肠腔后对准膨大壶腹中心插入胆胰管约1 cm，微量泵以0.1 mL/min速度推注5%牛磺胆酸钠，观察2～4 min后拔管，去除动脉夹，缝合十二指肠穿刺口并关腹，术中注意无菌操作。术毕皮下注射2 mL/100 g生理盐水，以补充丢失水分。大鼠清醒后自由饮水、进食。SO组：采用0.9%氯化钠溶液代替5%牛磺胆酸钠方法制作模型，具体步骤同上。大鼠清醒后自由饮水、进食。C组：正常饮水，进食。
1.4 检测项目
1.4.1 证象观察
造模后每只大鼠逐日称体重及测量肛温，观察精神、毛色、大便及舌质、舌苔等证象。
1.4.2 血淀粉酶测定 造模后第1、2、3、5日，SAP组、SO组分别取6只大鼠，麻醉后心脏采血处死，留取血液-20℃保存备用，采用麦芽糖苷法测定血浆淀粉酶水平。
1.4.3 胰腺组织病理检查
造模后第1、2、3、5日，SAP组、SO组分别取6只大鼠，麻醉后心脏采血处死，留取胰腺组织，4%多聚甲醛固定，常规苏木精-伊红染色行病理检查。胰腺组织经固定后，常规石蜡包埋，4 μm切片。二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，入苏木精染液染色10 min，自来水冲洗。盐酸乙醇分化约10 s，至细胞核着色较深，其他结构无色时为宜。入自来水缓洗约20 min，使苏木精“蓝化”，胞核呈蓝色。经蒸馏水洗后，入伊红染液染色约10 min，用蒸馏水洗去多余的伊红。常规脱水，透明，封片。应注意在苏木精和伊红染色时，须随时在显微镜下观察是否适当，如染色过浅，应重复染色。
1.4.4 血浆内毒素测定
大鼠血浆内毒素测定采用鲎试剂基质偶氮显色定量法。
1.4.5 血清肿瘤坏死因子α测定
按照肿瘤坏死因子α(TNF-α)定量酶联检测试剂盒说明书进行测定。
1.5 统计学方法
用SPSS11.5软件包进行统计学分析。所有计量数据采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析及q检验(Student Newman Keuls Test)。分类计数资料采用Pearson Chi-square (χ2检验)统计方法统计。P&<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 造模后大鼠证象变化
2.1.1 舌苔改变
SAP组：与C组比较，大鼠舌象出现明显变化，部分大鼠舌苔向中后部逐渐增厚，至第5日存活大鼠中出现厚腻苔者共计29只，发生率42.6%，其中黄腻苔10只;舌苔基本正常者39只。SO组：至第5日存活大鼠26只，舌苔与C组比较无变化。C组：无异常记录。
2.1.2 一般反应情况
SAP组：大鼠出现倦怠、耸毛，部分大鼠出现便溏。出现便溏的大鼠情况：A组19只，出现频率为65.5%;B组17只，出现频率为43.5%。经χ2检验，二者比较P=0.002，差异有统计学意义。SO组：大鼠麻醉苏醒后活动略减少，次日开始即饮食、活动基本正常，无倦怠、耸毛;大便正常，未现便溏。C组：无异常记录。
2.1.3 体温变化
各组大鼠体温与C组比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。舌苔厚腻的A组体温略有升高趋势。
2.1.4 体重变化(见表1)
2.2 各组大鼠血淀粉酶变化情况
(见表2)表1 各组大鼠体重变化情况表2 各组大鼠血淀粉酶水平比较
2.3 各组大鼠胰腺形态学及组织病理改变情况
C组大鼠胰腺肉眼所见，呈均匀淡粉色，形态正常，有光泽，腹腔内无腹水，腹腔内器官未见异常改变。SAP组大鼠注射5%牛磺胆酸钠后约10 min，即可见胰腺充血、出血及渗出增多。2 h后可见皂化斑点形成。造模后5 d胰腺失去正常形态，胰腺可见坏死，与周围组织粘连严重，胰腺表面可见皂化斑，有少量腹水。SO组大鼠胰腺形态基本正常。造模5 d后SAP大鼠模型光学显微镜下可见：胰腺实质大片坏死，腺泡及导管失去正常形态，出血及脂肪坏死增多，大量中性粒细胞浸润，有钙化形成。
2.4 各组大鼠血浆内毒素、血清肿瘤坏死因子α变化情况
(见表3、表4)表3 各组大鼠血浆内毒素水平比较表4 各组大鼠血清TNF-α水平比较
3 讨论
本研究结果显示：采用5%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注入制成的SAP大鼠模型，血淀粉酶水平明显升高，胰腺形态及病理改变可见胰腺充血、出血及渗出增多，胰腺失去正常形态，有皂化斑点形成，出血及脂肪坏死增多，大量中性粒细胞浸润。结果支持SAP模型的成功建立。
在温病模型的探讨中，湿热证模型研究相对较晚。基于中医对于湿热证病因认识的发展，近年认为湿热证的外因湿热毒邪是多重性概念，既包括自然湿热气候，又包括病原微生物等在内，故王氏、吴氏等[2-3]陆续采用增加生物感染因素来制作温病湿热证动物模型。吴氏等[3]比较6种不同的造模方法，认为以饮食因素+气候环境+致病生物因子(感染)的综合因素实验方法造成温病湿热证大鼠模型较为理想。丁氏等[4]观察了湿热环境、肥甘饮食、内毒素分别和共同作用下，动物的症状、体征等，认为内毒素是形成典型湿热证的主要因素，环境、饮食是重要辅助因素。综合多家学说[5-8]，总结温病湿热证造模成功的指标包括：明显倦怠嗜卧，耸毛，大便烂，进食少，体重减轻，舌质黯红，或舌苔黄腻。动物模型制作也多以饮食失调+高温+高湿+致病生物因子感染的综合因素造模为主，造模所需时间较长，从一定程度上来说符合湿热类温病的发病特点。但我们在多年诊治感染性疾病并多脏器功能不全的临床实践中，发现很多急性感染患者，在病情发展过程中出现湿热的证候，而并没有高温、高湿的外在环境。如胡氏等[9]观察59例SARS患者舌象情况，发现在病程的早期及中期(极期)，厚腻苔(白或黄)的出现率均占据首位。
对于中医动物模型的研究，陈氏[10]认为模型应尽量选择在其日常生活中就能出现相应证候的动物，证、病结合模型的研究，即在同一动物体上同时复制具有相互联系的现代医学的病及中医证候，也促进了对病、对证、对完整疾病(证病统一体)的认识及相应模型的发展，促进了证候模型与临床的紧密结合及应用。基于此，我们结合临床所见，采用了湿热证发病率较高的SAP动物模型作为观察对象，来建立一个与急性热性病湿热证病情发展更符合的动物模型。
察舌辨证是温病学临床诊疗的重要内容。清?吴鞠通《温病条辨》中明确指出，黄燥苔和滑腻苔各是温热类热性病和湿热类热性病的特征性舌苔，湿热轻重不同，滑腻苔也有白滑、淡黄而滑等不同。阎氏等[11]采用高脂高糖饮食、高湿、高温，外加鼠伤寒沙门氏菌感染制成温病湿热证大鼠模型，亦发现湿热组大鼠舌质红，苔腻微黄;湿重于热组舌质淡红，苔白腻。故本实验把舌苔厚腻与否作为判断模型湿热证是否存在的指标。本研究结果表明，部分SAP大鼠舌苔出现厚腻(发生率42.6%)。
目前，现代医学对SAP的病理生理机制研究还不甚明了，有研究显示，感染、内毒素血症、炎症介质的释放参与了急性胰腺炎的发病机制[12]。Schwarz M等[13]报道，在急性胰腺炎早期即存在细菌的感染，在起病8～16 h，对于胰腺、肝、脾、肠系膜淋巴结组织进行细菌培养即有阳性发现。本实验结果显示， SAP大鼠血浆内毒素、TNF-α水平在发病过程中均有不同程度的升高，提示内毒素血症、炎症介质参与了此模型的病理生理过程，且符合目前中医对于湿热证的外因湿热毒邪的认识。本模型大鼠体温未见明显升高，与中医认为湿热证发热大多表现为身热不扬的临床证候特点也一致。重要的是，在SAP大鼠的发病过程中，造模5 d，部分大鼠出现了舌苔厚腻的表现，与临床所见湿热象的舌苔表现很相似，结合SAP大鼠造模后出现倦怠、耸毛、便溏、体重下降，可以考虑SAP大鼠模型是一个更符合临床急性热性病湿热证发病过程的动物模型。
参考文献
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