作者：施婧妮，陈进文，高建蓉，唐尹萍，胡春玲，周莉，刘焱文
【摘要】 目的 建立生鳖甲与醋鳖甲抗肝纤维化有效物质部位的高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱，探讨其炮制前后药效物质的差异。方法 运用毛细管区带电泳法，75 μm×57 cm 未涂层石英毛细管，运行缓冲液为20 mmol/L磷酸氢二钠-100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(l mol/L NaOH调pH值至12.0)，分离电压为18 kV，检测波长为254 nm，柱温为20 ℃，分别建立了10批生鳖甲和10批醋鳖甲有效物质部位的指纹图谱，并进行对比研究。结果 生鳖甲指纹图谱共标定了17个共有峰，HPCE图谱相似度均大于0.94；醋鳖甲指纹图谱共标定了19个共有峰，HPCE图谱相似度均大于0.93；而10批生鳖甲图谱与醋鳖甲对照指纹图谱的相似度降低，为0.86～0.92；且10批醋鳖甲图谱与生鳖甲对照指纹图谱的相似度亦降低，为0.86～0.93。结论 鳖甲炮制前后化学成分及其含量发生了变化，且炮制后产生了一些新的有效成分。
【关键词】 鳖甲；炮制；有效成分；高效毛细管电泳；抗肝纤维化；指纹图谱
Abstract：Objective A fingerprint method was established for comparing the same geographical origin of pre-and-post-processed Trionyx sinensis carapace in anti-liver fibrosis， 10 crude samples and 10 vinegar- processed were analyzed. Method Using HPCE detection method equipped with uncoated fused silica capillary column (75 μm×57 cm)， with 20 mmol/L Na2HPO4-100 mmol/L Tris (pH＝12) as background electrolyte， UV detector at 254 nm， voltage of 18 kV and detection temperature of 20 ℃. Results Seventeen co-possessing peaks were selected as the fingerprints of 10 crude samples， the similarity of the fingerprint were above 0.94. Nineteen co-possessing peaks were selected as the fingerprints of 10 vinegar-processed samples， the similarity of the fingerprint were above 0.93. The similarity between 10 crude samples and the contrast fingerprint of vinegar-processed samples dropped to 0.86～0.92， so did the similarity between 10 vinegar-processed samples and the contrast fingerprint of crude sample， dropped to 0.86～0.93. Conclusion The content of Trionyx sinensis carapace appears to change greatly before and after vinegar processing， and some new compounds emerged after processing.
Key words：Trionyx sinensis carapace；processing；effective components；HPCE；anti-liver fibrosis；fingerprint
鳖甲为鳖科动物鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲，始载于《神农本草经》，收载于历年版《中华人民共和国药典》，具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸的功效[1]，是临床用于治疗肝纤维化疾患的常用中药，多采用醋制鳖甲入药[2]。中医理论认为，生鳖甲养阴清热、潜阳熄风之力较强，用于热病伤阴或内伤虚热、虚风内动等证；鳖甲砂炒醋淬后，质地酥脆，能增强入肝消积、软肝散结的作用.
本试验室前期对鳖甲抗肝纤维化的有效物质进行了初步研究，将醋鳖甲提取物用透析膜分为分子量小于7 000和分子量大于7 000的2个物质部位。药理试验结果表明，鳖甲提取物中的肽类物质(分子量小于7 000)具有明显抗肝纤维化的作用[3]；并采用高效毛细管电泳(HPCE)分析方法，建立了鳖甲抗肝纤维化有效物质部位的指纹图谱，其色谱峰清晰、相似度良好，且方法可靠性强[4]。为了探讨鳖甲炮制前后化学成分的变化，本研究分别测定了生鳖甲与醋鳖甲抗肝纤维化有效物质部位的HPCE指纹图谱，对其炮制前后的指纹图谱进行了分析比较。
1 仪器与试药
Beckman P/A system 5000型HPCE仪(美国Beckman公司)，融熔石英毛细管柱(75 μm×57 cm，有效长度49 cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司)，冷冻干燥机FD-1A-50(北京博医康实验有限公司)，KQ-250B超声波清洗器，78-1型磁力加热搅拌器，万分之一分析天平(METTLER TOLEDO AL204)，828型奥立龙pH计，透析膜(GREEN BIRD，截留分子量7000)。三羟甲基氨基甲烷(Tris)为优级纯，水为双蒸水，磷酸氢二钠、氢氧化钠为分析纯。鳖甲药材由浙江衢化医院提供，均来源于浙江衢化地区，其中10批醋鳖甲分别由10批生鳖甲按照《中华人民共和国药典》[1]方法炮制而成。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
称取生鳖甲粉末25.0 g，加200 mL水超声提取20 min，抽滤，残渣加水100 mL超声10 min，抽滤，合并滤液，冷冻干燥得冻干粉，用少量水溶解置于透析膜内，膜外溶液为纯水约200 mL，透析2次，每次5 h，合并膜外溶液，冷冻干燥。精密称取冻干粉加水配制成浓度为5.0 mg/mL的溶液，经0.22 μm滤膜过滤，作为供试品溶液；照生鳖甲供试品溶液同法制成醋鳖甲供试品溶液。
2.2 对照品溶液和有效组分对照溶液的制备
将本实验室从鳖甲抗肝纤维化的有效物质部位中分离得到的活性五肽“HGRFG”，配制浓度为0.1 mg/mL的水溶液，作为对照品溶液；将本实验室经柱色谱分离和药理筛选得到的活性组分肽Bj4，配制浓度为0.1 mg/mL的水溶液，作为有效组分对照溶液。
2.3 色谱条件
未涂层石英毛细管75 μm×57 cm，有效长度49 cm；检测波长：254 nm；压力进样：5 kPa， 5 s；分离电压：18 kV；柱温：20 ℃；运行缓冲液：20 mmol/L磷酸氢二钠-100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(1 mol/L NaOH调pH值至12.0)。
2.4 指纹图谱的测定
2.4.1 生鳖甲高效毛细管电泳指纹图谱及技术参数 取同一产地的10批生鳖甲粉，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录30 min电泳图。标定了17个共有峰，以色谱图中较稳定和峰面积较大的14号峰作为参照峰s，测定各共有峰相对保留时间(共有峰与参照峰保留时间的比值)以及相对峰面积(共有峰与参照峰面积的比值)。分析结果表明，10批样品的17个对应共有峰的相对保留时间RSD小于3.0%，相对峰面积的RSD小于10.0%，共有峰占总峰面积的比值均大于95.0%，符合指纹图谱的技术要求。将有效组分对照溶液在上述色谱条件下进样分析，通过对比相对迁移时间，指认该成分为1号峰(见图1)。
2.4.2 醋鳖甲高效毛细管电泳指纹图谱及技术参数 取同一产地的醋鳖甲粉，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件进行分析，记录30 min电泳图。醋鳖甲共标定了19个共有峰，以图谱中较稳定以及峰面积较大的15’号峰作为参照峰s，测定各共有峰相对保留时间(共有峰与参照峰保留时间的比值)以及相对峰面积(共有峰与参照峰面积的比值)。分析结果表明，10批样品的19个对应共有峰的相对保留时间RSD小于3.0%，相对峰面积的RSD小于10.0%，各样品中共有峰占总峰面积的比值均大于95.0%，符合指纹图谱的技术要求。将有效组分和对照品溶液在上述色谱条件下进样分析，通过对比相对迁移时间，指认活性组分Bj4为1’号峰，对照品活性五肽为3’号峰(见图2)。
图1 生鳖甲有效物质部位与有效组分对照溶液的HPCE图谱
图2 醋鳖甲有效物质部位与对照溶液及有效组分对照溶液的HPCE图谱
2.5 鳖甲炮制前后有效物质部位指纹图谱的对比研究
2.5.1 指纹图谱的比较研究 为了便于分析，将生鳖甲和醋鳖甲的HPCE指纹图谱分为3个区(见图3、图4)。
图3 生鳖甲与醋鳖甲指纹图谱的对比图
图4 生鳖甲与醋鳖甲对比指纹图谱Ⅱ区放大图
Ⅰ区，保留时间为2～5 min，此区鳖甲炮制前后化学成分无明显差异，但成分含量发生了变化，生鳖甲与醋鳖甲指纹图谱中对应位置均出现第1、2号峰，其中1号峰(指认为活性组分肽Bj4)为最强峰，生鳖甲1号峰单峰面积占总峰面积约4%，但鳖甲醋制后该峰占总峰的面积则升高至约20%。Ⅱ区，保留时间5～11 min，鳖甲炮制前后的指纹图谱在这一区域中的差异最为明显，其中生鳖甲中的峰3、4、5、7、9、10、11、13分别与醋鳖甲中的峰4’、5’、6’、7’、9’、10’、11’、13’相对应，因Ⅱ区中的峰面积普遍较小，故占总峰的面积差别不大。醋鳖甲中的峰3’、峰14’为炮制后产生的新成分，其中峰3’被指认为活性五肽。Ⅲ区，保留时间为11～30 min，在此区中鳖甲炮制前后的指纹图谱并未出现太大的改变，炮制后峰16’含量极低(占总峰面积约0.4%)，生鳖甲中的峰14、15、16、17与醋鳖甲中的峰15’、17’、18’、19’相对应，但炮制后这4个特征峰的含量均有所下降，其中生鳖甲中峰17(对应醋鳖甲中的峰19’)经炮制后其含量下降近一半。综合分析，3个区段中表观峰度最强的是Ⅲ区，而最能反映炮制前后化学成分变化情况的是Ⅱ区；活性组分肽Bj4色谱峰处于Ⅰ区，活性五肽“HGRFG”对照品色谱峰位于Ⅱ区。从生鳖甲和醋鳖甲的对比图谱分析可见，鳖甲炮制前后化学成分的含量发生了变化，且炮制后产生了一些新的有效成分。
2.5.2 相似度的评价 采用2种算法来进行，一种是相关系数法，另一种是向量夹角余弦法[5]。以峰面积为指标，选择平均矢量作为对照指纹图谱，按照公式(1)和(2)计算同一产地鳖甲抗肝纤维化活性部位的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。
相关系数 ＝ 夹角余弦 ＝ 公式中Xi为某个样品对应保留时间下的峰面积，Yi为n批样品(n≥10)对应保留时间下的平均峰面积(对照指纹图谱)。采用Excel强大的数据处理功能计算，计算迅速、结果准确可靠。
采用相关系数法和夹角余弦法对指纹图谱进行综合评价，使相似度评价结果更为可靠，2种方法的计算值虽然不完全相同，但分析结果基本一致。同一产地10批生鳖甲图貌基本一致，均显示了相应成分的色谱峰，且生鳖甲药材HPCE相似度均大于0.94(见表1)，说明浙江衢化地区鳖甲药材的差异较小，10批生鳖甲醋制后指纹图谱相似度均大于0.93(见表2)，表明鳖甲的炮制方法具有较好的稳定性和重现性；10批生鳖甲指纹图谱与醋鳖甲对照指纹图谱的相似度在0.86～0.92波动(见表3)，10批醋鳖甲指纹图谱与生鳖甲对照指纹图谱的相似度在0.86～0.93波动(见表4)，较之10批生鳖甲指纹图谱或10批醋鳖甲指纹图谱的相似度均明显降低，说明鳖甲醋制前后的化学成分和含量存在较大差异。
表1 生鳖甲抗肝纤维化活性部位HPCE指纹图谱相似度
算法 样品 对照
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
相关系数 0.966 5 0.968 8 0.978 1 0.969 8 0.997 2 0.946 4 0.969 7 0.969 3 0.989 9 0.979 7 1
夹角余弦 0.979 7 0.969 0 0.989 8 0.979 9 0.999 8 0.947 3 0.979 7 0.989 4 0.989 7 0.999 8 1
表2 醋鳖甲抗肝纤维化活性部位HPCE指纹图谱相似度
算法 样品 对照
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
相关系数 0.963 4 0.954 3 0.974 3 0.965 8 0.989 0 0.939 4 0.951 2 0.968 0 0.984 8 0.995 6 1
夹角余弦 0.975 7 0.959 2 0.996 3 0.989 3 0.999 4 0.942 9 0.974 3 0.968 6 0.999 0 0.997 1 1
表3 10批醋鳖甲与生鳖甲对照指纹图谱的相似度
算法 样品 对照
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
相关系数 0.892 0 0.863 8 0.870 5 0.898 3 0.878 3 0.879 3 0.901 2 0.884 6 0.860 5 0.866 9 1
夹角余弦 0.915 2 0.893 7 0.899 6 0.921 3 0.905 4 0.905 5 0.923 5 0.910 2 0.891 8 0.896 9 1
表4 10批生鳖甲与醋鳖甲对照指纹图谱的相似度
算法 样品 对照
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
相关系数 0.892 0 0.863 8 0.870 5 0.898 4 0.878 3 0.879 3 0.901 3 0.884 6 0.860 5 0.866 9 1
夹角余弦 0.910 7 0.889 3 0.895 1 0.916 7 0.900 9 0.901 0 0.918 9 0.905 7 0.887 4 0.892 5 1
3 讨论
为了提高生鳖甲和醋鳖甲HPCE指纹图谱的可比性，本试验选用的10批生鳖甲药材均购自浙江衢化地区，且醋鳖甲药材均由相应的生鳖甲按照《中华人民共和国药典》[1]方法炮制。
鳖甲抗肝纤维化活性肽类物质国内外尚未见报道，无对照品出售。本试验前期在抗肝纤维化药理试验跟踪下，从鳖甲抗肝纤维化有效物质部位分离和筛选出活性组分肽Bj4，将其作为对照组分；分离和鉴定出了活性五肽“HGRFG”，将其作为对照品。将上述有效物质作为评价指标，对鳖甲炮制前后指纹图谱进行比对和指认。结果表明，活性五肽“HGRFG”对照品为鳖甲炮制后产生的新物质。
我们前期对鳖甲炮制前后抗肝纤维化有效物质部位药理试验比较研究表明，醋制鳖甲的药理作用明显优于生鳖甲(另文报道)。本试验对鳖甲炮制前后的指纹图谱进行了分析比较， 两者指纹图谱中的指纹峰的数量和峰面积均存在较大差异，鳖甲醋制品的指纹峰明显多于生鳖甲，从中指认了炮制后新产生的活性五肽“HGRFG”指纹峰，且其色谱图中与生鳖甲对应的活性组分Bj4占总峰面积升高了4倍多。从而阐释了鳖甲醋制品抗肝纤维化作用优于生鳖甲的药理效果，也为鳖甲醋制品用于临床肝纤维化疾患提供了一定的科学依据，并为进一步探讨鳖甲醋法炮制的机理奠定了良好的基础。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，2005：266.
[2] 徐忠可.金匮要略论注[M].上海：上海古籍出版社，1991：56.
[3] 高建蓉，张赤志，邵志华，等.鳖甲对肝星状细胞增殖影响的研究[J].实用医学杂志，2007，23(11)：1618－1620.
[4] 陈进文，高建蓉，王光忠，等.鳖甲抗肝纤维化有效物质部位高效毛细管电泳指纹图谱研究[J].中药材，2009，32(6)：848－851.
[5] 苗爱东，孙殿甲.Excel 2002在中药指纹图谱相似度计算中的应用[J].药学进展，2003，27(1)：51－54.