【摘要】 目的 探讨红景天对卒中后抑郁(PSD)大鼠海马组织细胞因子的干预作用。方法 选用健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、单纯缺血组、PSD组及红景天低、中、高3个剂量组。制作PSD大鼠模型，术后21 d内红景天低、中、高剂量组每日以红景天灌胃给药，其余各组以同样给药途径予等剂量的生理盐水，于第1、7、14、21日时进行行为学观察和测试，于第21日时进行海马HE染色观察病理变化，测定海马组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的含量。结果 与假手术组比较，各组大鼠海马组织TNF-α、IL-1β含量不同程度增高，而IL-6含量则减少，抑郁的行为学评分下降(P&<0.01)，HE染色示海马神经细胞受损;与单纯缺血组比较，PSD组大鼠海马组织TNF-α、IL-1β含量明显增高，而IL-6含量则明显减少，抑郁的行为学评分明显下降(P&<0.01)，HE染色示海马神经细胞受损明显;与PSD组比较，红景天低、中、高剂量组均能不同程度减少海马组织TNF-α、IL-1β含量，升高IL-6含量，减少海马神经细胞的受损程度，提高抑郁的行为学评分(P&<0.01)，其中红景天中、高剂量组较低剂量组作用更明显(P&<0.05)，但中、高剂量组间无明显差异(P&>0.05)。结论 PSD大鼠海马组织细胞因子网络稳态发生改变，海马损伤进一步加重;红景天对PSD大鼠海马有保护作用，可能是通过降低致炎性细胞因子的产生而促进抗炎性细胞因子的产生而实现的。
【关键词】 卒中后抑郁;海马;细胞因子;红景天;大鼠
Abstract：Objective To study the interference of Hongjingtian in cytokines in hippocampus of post stroke depression (PSD) rats. Methods The healthy SD rats were randomly pided into five groups：simple focal cerebral ischemia group， PSD group， Hongjingtian group of three doses [2.5， 5， 7.5 g/(kg·d)]. PSD rats model was established. Hongjingtian group was given Hongjingtian and other groups were given normal saline. The ethological score of depression was evaluated. Pathological changes of hippocampus were observed by HE staining and the content of TNF-α， IL-1β and IL-6 in hippocampus were measured. Results Compared with normal group， the expression of the content of TNF-α and IL-1β of other groups increased， while the content of IL-6 decreased， the ethological score of depression decreased. HE staining of hippocampus showed neurocyte damaged obviously. The difference between them was significant (P&<0.01). Compared with simple focal cerebral ischemia group， the content of TNF-α and IL-1β in model group increased， while the content of IL-6 decreased. The ethological score of depression decreased. HE staining of hippocampus showed neurocyte damaged obviously. The difference between the two groups was significant (P&<0.01). Compared with model group， Hongjingtian groups decreased the content of TNF-α and IL-1β， increased the content of IL-6， and increased the ethological score of depression， reduced the damaged extent of neurocyte of hippocampus. The difference between the two groups was significant (P&<0.01). The effects of medium-dose and high-dose groups were more obviously compared with the low-dose groups (P&<0.05)， but there was no difference between them (P&>0.05). Conclusion The steady state of network of cytokines in PSD experienced disequilibrium and neurocyte of hippocampus were damaged worse than that in simple focal cerebral ischemia. Hongjingtian has neuroprotective effects on PSD rats， its mechanism may through improving the damaged extent of neurocyte of hippocampus by way of reducing the content of TNF-α， IL-1β and increasing the content of IL-6 in hippocampus.
Key words：post stroke depression;hippocampus; cytokines;Hongjingtian;rat
卒中后抑郁(PSD)是脑卒中后的一个常见并发症。由于近年来卒中患者的不断增多，PSD患者的比例逐年上升，显著增加了卒中患者的病死率、致残率和认知功能障碍，降低了患者生存质量。目前虽已有药物用于临床，但疗效均不理想，无效率仍高达20%～40%[1]。临床上应用红景天治疗缺血性心脏病及缺血性脑血管病等已取得了良好疗效。笔者通过观察其对PSD大鼠海马组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平及PSD大鼠行为学的影响，从而为PSD的治疗提供新的实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SD大鼠60只，体重180～240 g，辽宁医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(辽)。实验动物级别：普通级。
1.2 药物和试剂
红景天购于吉林白山市药材责任有限公司;IL-1β、TNF-α、IL-6试剂盒购自天津千叶生物技术有限公司。
1.3 仪器
DH-I型动物人工呼吸机：浙江医科大学仪器试验厂;低速离心机：北京医用离心机厂;BH6018型四探头自动γ计数器：北京核仪器厂;电子天秤：上海天平仪器厂;连续变倍体视显微镜160x：桂林仪器厂;石英自动双重纯水蒸馏器：江苏丹阳门石英玻璃厂;LEICA-RM-2135石蜡切片机：德国;烘片、烤片机：孝感市电子仪器厂;OLYMPUS万能显微镜：日本;CIAS-1000型图像分析仪：北京大恒图像视觉有限公司;电热干燥箱：余姚工业仪表二厂。
2 实验方法
2.1 分组与给药
遵循随机原则，将60只大鼠分为假手术组、单纯缺血组、PSD组及红景天高、中、低剂量组，每组10只。红景天组分别按原药材2.5、5、7.5 g/(kg·d)溶于2 mL生理盐水中灌胃给药21 d，其余各组每日以同样给药途径予等剂量的生理盐水灌胃21 d。
2.2 大鼠局灶性脑缺血模型的建立
参考文献
[2]方法，手术前12 h禁食不禁水。选用标准大鼠麻醉剂量，以10%水合氯醛0.3 mL/100 mg，经腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上，颈部正中切开皮肤及浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露左侧颈总动脉(CCA)和迷走神经、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)、ICA的颅外分支-翼腭动脉，在近心端结扎CCA，在CCA分叉处结扎ECA，结扎翼腭动脉。将ICA远心端用动脉夹夹闭，距颈总动脉分叉处近心端0.5 cm处将CCA剪一小口，插入备好的碳素鱼线，去除动脉夹，沿着ICA轻轻向前推进，注意不要误入翼鄂动脉，当到达指定长度(18 mm左右)时结扎ICA并固定鱼线。假手术组除手术过程中不插入线栓以外，其他过程相同。以青霉素局部消毒后缝合皮肤。术后保持环境温度在25～30 ℃左右，尤其要注意动物头部的保温。模型成功的标志是大鼠即刻出现右侧Horner征。2.3 大鼠卒中后抑郁模型的制备
参考文献
[3-4]方法。①禁食禁水20 h;②禁水17 h;③倾斜鼠笼(45°)17 h;④持续光照17 h;⑤湿笼(100 g锯屑+200 mL水)21 h;⑥4 ℃游泳5 min;⑦水平摇晃5 min;⑧行为限制2 h;⑨夹尾1 min。9种刺激每日随机采取1种，共21 d，单笼饲养。2.4 观察指标
2.4.1 行为学观察和测试 造模后第1、7、14、21日，行旷野实验测试，每周行蔗糖水实验并测量体重。①旷野实验：室内隔音，测定5 min水平及垂直运动得分。②蔗糖水实验：20 h禁食禁水后，测定1 h糖水饮用比例(糖水消耗/总液体消耗×100%)。③体重测量：每周测量各组体重。
2.4.2 脑组织病理形态学观察 以10%水合氯醛(0.3 mL/100 mg)腹腔注射麻醉，打开颈部，暴露颈右总动脉，插管，先输注生理盐水约50 mL，然后输注4%多聚甲醛约50 mL，断头取脑。甲醛固定，冠状脑片制备，选择梗死中心(即最大层面)，常规酒精脱水，石蜡包埋，制成4～6 ?m厚的切片，附片行苏木素-伊红(HE)染色，分别观察梗死中心区、梗死周边区脑组织(海马CAl、CA3区)神经细胞和血管内皮细胞(每个观察区选择具有代表性标本观察结果并记录)。
2.4.3 细胞因子检测 21 d后各组大鼠分别迅速断头，剥离出脑，在冰浴下迅速分离海马组织，制备组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，吸取上清液，采用放射免疫分析法检测IL-1β、TNF-α、IL-6。实验按说明书操作。
3 统计学方法
实验数据计量资料均用—(—数)±s表示，采用SPSS16.0统计软件进行方差分析。
4 结果
4.1 大鼠行为学和测试结果(见表1～表3)
4.2 海马组织细胞因子检测结果(见表4)表1 各组大鼠不同时点体重比较(—(—比)±s，g)注：与假手术组比较，*P&<0.05，**P&<0.01;与单纯缺血组比较，##P&<0.01;与PSD组比较，△△P&<0.01;与红景天组(低)比较，▼P&<0.05，表2 各组大鼠不同时点糖水消耗量比较(—(—消)±s，mL)表3 各组大鼠不同时点旷野实验水平运动得分比较(—(—实)±s，次/5 min)表4 各组大鼠不同时点海马组织细胞因子含量比较(—(—组)±s)
4.3 各组大鼠脑组织病理形态学变化
HE染色(×400)光学显微镜下观察，每组均可见正常神经元和损伤神经元。正常神经元核圆形，边界及核仁清楚;损伤神经元胞核肿大，偏位，核仁消失，胞浆着色浅、苍白或核浓缩、深染，细胞呈三角形缺血性坏死变化。损伤神经元上述特点在PSD组表现得更明显;红景天各剂量组能不同程度的改善神经细胞的核深染、核固缩程度，减少细胞及间质的水肿，使胞膜清楚，形态正常，核仁清晰可见的神经细胞数目增多。
5 讨论
PSD的发病机制仍不明确，多种学说并存。影像学研究及动物应激模型证实中度抑郁患者海马体积减少[5]，并可被抗抑郁药逆转[6]，从而提出了海马神经再生障碍假说。近年来有研究显示，细胞因子网络的异常有可能参与了PSD的发生[7-8]。多项实验表明，IL-6延迟性表达对缺血再灌注后海马神经元有保护作用，抑制IL-1β及TNF-α的合成，对抗谷氨酸引起的细胞损伤。而TNF-α及IL-1β对缺血再灌注后海马神经元有损伤作用[9]。以卒中后炎症反应为基础，Spallctta等[10]提出了关于PSD病因学的新假说，即细胞因子假说。他们认为细胞因子与5-HT通过吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO酶)的相互作用可能在PSD中起着重要作用：卒中后炎性细胞因子(如IL-1β、TNF-α)增多导致了炎症过程的增强(尤其是边缘区)和IDO酶的广泛激活，并继发旁边缘结构如前侧额皮质和基底节的5-羟色胺的耗竭。Craft等[11]在大鼠模型中的研究发现，侧脑室灌注IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)可以逆转大鼠的PSD样行为，表明PSD可能涉及脑内IL-1传递的改变。与单纯卒中相比，PSD患者可能有致炎性细胞因子水平的进一步升高或高峰持续时间延长，或抗炎性细胞因子水平的降低或反应性升高的延迟，即PSD患者体内可能存在着细胞因子网络稳态的失衡。给予抗炎性细胞因子或抗抑郁治疗后，患者可能出现炎性细胞因子水平降低或抗炎性细胞因子水平升高，细胞因子网络重新达到稳态，抑郁症状改善。
红景天是高山药用植物，已有多年临床应用经验，在治疗缺血性心脏病及缺血性脑血管病等方面已取得了良好疗效。文献报道，它能在极其恶劣而多变的自然环境中生长，具有扶正固本、益气化瘀、抗缺氧、增强免疫功能及双向调节等功效[12]。已有研究表明，红景天内含Cu-Zn-SOD与Mn-SOD，是重要的超氧自由基清除剂，直接提供并增加SOD水平[13]，其能促使血管内皮细胞产生一氧化氮(NO)，有效抑制ADP诱导的血小板聚集，改善血小板功能，恢复纤溶活性，抗体外血栓形成[14-16]。而其强大的免疫双向调节功能[12]又为其直接降低某些致炎性细胞因子水平增加抗炎性细胞因子水平，从而稳定细胞因子网络提供了理论上的可能依据。
本实验着眼于对PSD大鼠行为学的观察和测试、海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量的测定及海马CA1区脑组织病理形态学的观察。与单纯缺血组相比，PSD时海马损伤与细胞因子网络改变显著增加。红景天各剂量组均可以明显改善PSD的抑郁行为学特征及海马组织神经元损伤程度，显著减低海马组织的细胞因子TNF-α、IL-1β水平，而同时提高IL-6的含量。上述改变尤以红景天中、高剂量组显著，提示红景天对PSD具有保护作用。
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