【摘要】 目的 观察戊己水煎液(《太平惠民和剂局方》)对幽门螺杆菌(H·pylori)感染的SGC-7901细胞分泌白细胞介素-8(IL-8)的作用。方法 将H·pylori接种于SGC-7901细胞，然后加入不同浓度的戊己水煎液，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测SGC-7901细胞分泌细胞因子IL-8的含量。结果 戊己水煎液对H·pylori感染的SGC-7901细胞分泌的IL-8含量明显低于对照组，差异有显著性意义(P&<0.01)。结论 戊己水煎液对H·pylori感染的SGC-7901细胞分泌IL-8有抑制作用。
【关键词】 幽门螺杆菌；戊己水煎液；SGC-7901细胞；白细胞介素-8
自1983年澳大利亚学者分离和培养H·pylori以来，人类对H·pylori与胃黏膜疾病的关系进行了广泛深入的研究。一系列研究结果表明，H·pylori是慢性活动性胃炎的主要致病因素[1-2]，其引起的炎症反应是致病机制之一[3]。我国属H·pylori的高感染区，由于化学药物和抗生素的应用，产生了大量的耐药菌株。因此，许多学者从中药中寻求解决的办法。近几年研究显示，运用中药体内外抗H·pylori均有明显的优势，存在很大的潜力。
中药经方戊己丸(《太平惠民和剂局方》)是传统治疗胃部疾患的良好方剂。在治疗慢性胃炎、消化性溃疡的临床观察中，其疗效早有报道，但是治疗机理尚不十分清楚。本实验欲从体外探讨戊己丸对H·pylori感染性胃部疾患的作用机理。现报道如下。
1 实验材料
1.1 菌株和细胞
H·pylori采用国际标准菌株SS1 (sydney strain 1)，该菌株含有细胞空泡毒素(VacA)和细胞毒素相关基因(CagA)。人胃上皮细胞系SGC-7901细胞引自中南大学湘雅医学院细胞实验中心。
1.2 药物
戊己水煎液成分取自戊己丸(由黄连、吴茱萸、白芍等比例组成)，湖南中医药大学药学院植物药化学分析研究室与药物制剂研究室制备(浓度1 g/mL)。抗生素混合液(万古霉素10 mg/L，两性酶素B 2 mg/L，多粘菌素B 0.25 mg/L)自配。
1.3 试剂
空肠弯曲菌琼脂基础(上海腹泻病控制上海试剂供应研究中心)，RPMI 1640培养液(美国GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)，白细胞介素-8(IL-8)试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)。胰蛋白酶、DMSO(美国Difco公司)，蛋白质试剂盒(美国Sigma公司)。
1.4 仪器
WMZK-02型厌氧培养箱，浙江义乌冷冻机总厂；X-SB-1A型倒置显微镜，广西梧州光学仪器厂；3111型CO2水套培养箱，美国FORMA公司；TECAN SUNRISE型酶标分析仪，奥地利。
2 实验方法
2.1 H·pylori的活化
取0.1 mL冻融的H·pylori菌置于改良Skirrow琼脂培养基平板上，涂布均匀，于37 ℃微需氧环境(N2 85%，CO2 10%， O2 5%)培养72 h。
2.2 细胞培养
SGC-7901细胞用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液进行培养，转种时调整细胞的密度(1×105个/mL)。
2.3 白细胞介素-8的测定
利用Huang 等[4-5]方法进行。将SGC-7901细胞(1×105/mL)加入24孔培养板中，用RPMI 1640完全培基培养(含20%小牛血清，加双抗)，48 h后用Hank’s液清洗细胞2次；感染H·pylori：调整H·pylori的浓度，使细胞孔中细菌浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107 CFU/mL，加入细胞培养孔，4 mL/孔。37 ℃，微需氧环境培养24 h。取出细胞离心，收集上清，用ELISA法测IL-8(按照说明书严格操作)，492 nm处测得OD值，按照标准曲线得出IL-8的浓度。最后确定H·pylori对SGC-7901细胞的最佳感染浓度。测出感染H·pylori的SGC-7901细胞中IL-8的含量，选择IL-8含量最高的H·pylori浓度作为感染培养细胞的浓度，然后观察药物在不同浓度(1︰160、1︰320、1︰640、1︰1280)下对H·pylori的抑制作用及对IL-8含量的影响。
2.4 统计学方法
测得指标均用x±s表示，采用SPSS11.0进行统计分析。
3 结果
(见表1、表2)表1 不同浓度H·pylori对IL-8含量的影响(略)注：与1×104组比较，*P&<0.01，**P&<0.001表2 戊己水煎液对H·pylori诱导SGC-7901细胞分泌IL-8含量的影响（略）注：与阳性对照组比较，△P&<0.01；与1︰160组比较，#P&<0.05，##P&<0.01
4 讨论
本实验用的H·pylori为标准菌株SS1，结果证实，该菌可以刺激SGC-7901细胞分泌IL-8；将中药戊己水煎液加入感染H·pylori的细胞中，发现该药对H·pylori感染的SGC-7901细胞所分泌IL-8的含量明显降低。
转贴于目前H·pylori的作用机制尚不十分清楚，但炎症反应是H·pylori感染致病过程中的一个重要环节。其中IL-8显著增加，在黏膜炎症中起着重要作用 [6-7]。目前认为，胃上皮作为与H·pylori相互作用的主要部位是IL-8的一个主要来源。IL-8是H·pylori相关性胃炎发生发展中的一个重要调节因子[8-10]。Martin Guerrero等[11]和Kim等[12]发现，H·pylori感染者胃黏膜IL-8 mRNA及蛋白产生显著增加，其增加程度与H·pylori数量等相关。Suzuki[13]的研究结果与上述研究结果相仿，同时，用IL-8抗体处理黏膜组织后发现有H·pylori感染黏膜对中性粒细胞的趋化能力明显下降，提示IL-8在H·pylori相关性胃肠疾病发病中的作用。张氏等[14]的研究结果与上述结果相符。同时显示胃窦活动性炎症程度随着胃黏膜内IL-8含量增加而加重，它们之间有显著的相关性。这进一步表明，H·pylori感染诱导IL-8表达增加，加重局部炎症；提示H·pylori在致胃细胞因子表达、炎症迁延中起关键作用。陈氏等[15]检测H·pylori阳性患儿血清IL-8水平，结果显示，H·pylori患儿组较阴性组血清IL-8水平明显升高，差异有显著性(P&<0.01)。该结果证实细胞因子IL-8参与了H·pylori感染后的致病过程；H·pylori感染胃黏膜产生的炎症反应损伤与IL-8的过量产生有关。
IL-8是一种促炎症因子，能选择性诱导中性粒细胞，T淋巴细胞及嗜碱性粒细胞趋化，属一种C-X-C趋化因子。有资料报道，IL-8的增多与幽门螺杆菌感染具有时间-剂量依赖关系，根除幽门螺杆菌后胃液中IL-8含量急剧下降，胃黏膜中性粒细胞浸润的平均密度也明显降低[16]。本实验的结果与此报道一致。H·pylori感染引起胃黏膜大量炎性细胞浸润，由多种趋化因子介导，IL-8能将血液循环中的中性粒细胞聚集到炎症局部，从而导致胃黏膜炎症，引起一系列胃肠道症状。
本实验的结果表明，戊己水煎液具有减少因H·pylori导致IL-8增加的作用。这可能是戊己水煎液抑杀H·pylori，减少细胞炎症，使IL-8含量减少(因为所用SS1标准菌株含又细菌毒力岛-CagA，它诱导IL-8的分泌)；也可能是戊己水煎液刺激胃上皮细胞的抗炎症细胞因子分泌，抑制IL-8生成的结果，进而通过抑制胃黏膜细胞IL-8生成，减轻H·pylori对胃黏膜细胞的损伤程度，从而达到治疗H·pylori 相关性胃部疾患的目的。H·pylori可以抑制细胞的生长繁殖，而戊己水煎液通过抑杀H·pylori，保护感染细胞不坏死；通过调节感染细胞IL-8分泌量，减少细胞炎症；可能通过保护胃细胞内的脱氢酶等，而使细胞存活率提高。
以上实验表明，中药复方戊己水煎液治疗H·pylori相关性胃病有一定的价值，值得进一步探讨。
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