作者：胡建军，陈泽奇，钟广伟，李炜，尹耀慧
【摘要】 目的 筛选与偏头痛肝阳上亢型相关的蛋白质，进一步揭示偏头痛肝阳上亢证的分子机制。方法 用电刺激SD大鼠三叉神经节，并灌服附子汤的方法制造偏头痛肝阳上亢型模型。采用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离偏头痛肝阳上亢型大鼠脾脏淋巴细胞的总蛋白，PDQuest7.0图像分析软件识别差异表达的蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质量指纹图，搜索数据库鉴定蛋白质。结果 鉴定到的10个差异蛋白分别为：氯通道蛋白-1、硫氧还蛋白过氧化物酶-Ⅰ、硫氧还蛋白过氧化物酶-Ⅱ、专利蛋白WO979348序列、Rho GDP解离抑制因子α、肌动蛋白2/3复合物、神经微丝轻肽、蛋白酶体、热休克蛋白-27、膜联蛋白-A1。结论 这些蛋白可能与偏头痛肝阳上亢证的形成有关，本实验为进一步揭示偏头痛肝阳上亢证的发病机制提供了新的线索。
【关键词】 蛋白质组学；偏头痛；肝阳上亢证；脾脏淋巴细胞；大鼠
Comparative Proteomics Analysis on Splenic Lymphocytes in Migraine Rat Model with Hyperactivity of Liver-yang HU Jian-jun， CHEN Ze-qi， ZHONG Guang-wei， et al Xiangya Hospital Affiliated to Central South University， Changsha 410008， China Abstract：Objective To explore the molecule mechanisms of migraine with hyperactivity of liver-yang related proteins. Methods Animal model of migraine with hyperactivity of liver-yang was established through electrical trigeminal ganglion stimulation， and by administering orally with Fuzi decoction. The total proteins of splenic lymphocytes in the rats were separated by immobilized pH gradient-based two-dimensional gel electrophoresis. With coomassie blue staining， the 2-DE images were analyzed by PDQuest 7.0 software. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) and database were used to identify the differential proteins. Result Ten differential spots protein were identified， and they were chloride intracellular channel 1， thioredoxin peroxidase Ⅰ， thioredoxin peroxidase Ⅱ， sequence 7 from patent WO9709348， Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha， actin related protein 2/3 complex neurofilament light polypeptide， proteasome subunit beta type and heat shock protein-27， annexin A1. Conclusion These protein may be involved in the development of migraine with hyperactivity of liver-yang. These data provide useful clues for elucidating the mechanisms of migraine with hyperactivity of liver-yang.
Key words：proteomics；migraine；hyperactivity of liver-yang；splenic lymphocytes；rat
偏头痛(migraine)在以头痛为症状的疾病中占有很重要的地位，在美国，约有17.2%的女性和6%的男性曾有偏头痛发作[1]。本病2/3患者为单侧头痛，1/3为双侧，每次发作延续数小时或数天，间隔不规律，数天数月甚至数年可再发，至今其发病机制仍未完全明确。有研究表明，偏头痛和肝阳上亢证均与免疫失调有关[2-3]。为此，笔者以偏头痛肝阳上亢型模型大鼠、对照组大鼠脾脏淋巴细胞为研究对象，采用双向凝胶电泳、质谱技术筛选与偏头痛肝阳上亢证相关的蛋白质，以揭示偏头痛发生发展的机制，为其治疗提供新的靶点。
1 实验材料
1.1 动物
雄性SD大鼠20只，清洁级，体重(200±20)g，中南大学实验动物学部提供，许可证号：SYXK(湘)2005-0005。
1.2 试剂及药物
大鼠淋巴细胞分离液为天津灏洋生物有限公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、固化pH梯度干胶条(IPG trip， pH3-10NL， 24 cm)为Amersham公司产品；二硫苏糖醇(DTT)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮-胰蛋白酶(TPCK-Trypsin)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、α-氰基-4羟基肉桂酸(CCA)为Sigma公司产品。附子汤由50 g单味制附子(由中南大学湘雅医院中药房提供)组成，将药物先泡30 min，煎煮两次后合并浓缩为含原药材0.32 g/mL的药液，4 ℃保存。
1.3 仪器
STOELTING TL-2鼠脑定位仪，美国产；生理电子刺激仪(SDQ-1型)，蚌埠实用技术研究所产品；旋转平台，根据文献[4]自制；Ettan DALTⅡSystem垂直电泳槽及ImageScanner扫描仪(Amersham公司)；PDQuest7.0分析软件(Bio-Rad公司)；EXL800自动酶标仪(Bio-Tek Instrument公司)；Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS 质谱仪(Applied Biosystem公司)。
2 实验方法
2.1 造模
①偏头痛模型复制参照文献[5]方法，实验动物予10%水合氯醛麻醉(0.4 mL/100 g)，在头顶作正中切口，在前囟旁3.0～3.2 mm(根据动物大小可变动)、后3.3 mm处用手术刀凿出一直径2 mm的小孔。操作鼠脑立体定位仪将不锈钢电极由钻孔处垂直插入，深度在硬脑膜下9.2 mm处(达三叉神经节)。应用生理电子刺激仪进行电刺激，刺激电流1.0 mA，5 Hz，波宽5 ms，持续10 min。完毕后拔除电极，缝合头皮，外敷青霉素粉剂预防感染。手术过程及苏醒期间，以60 W灯泡维持体温在37 ℃。②肝阳上亢证复制：参照鄢氏等[4]的方法，连续灌服附子汤2 mL/次，每日1次，共21 d，复制成偏头痛肝阳上亢动物模型。
2.2 分组
20只大鼠随机分为2组，每组10只。假手术对照组(对照组)大鼠麻醉，手术，但电极只插入4.5 mm深度，不做电刺激，缝合头皮伤口，蒸馏水灌胃2 mL/次，1次/d，共21 d。偏头痛肝阳上亢组(模型组)大鼠麻醉，手术，电刺激10 min，附子汤灌胃2 mL/次，1次/d，共21 d。实验中动物无脱落。
2.3 组织标本的处理
所有动物在处死前均腹腔注射麻醉剂(10%水合氯醛0.4 mL/100 g)，待动物麻醉后，剪开腹腔，找到脾脏，用预冷的生理盐水清洗后，经100目不锈钢网研磨，收集细胞悬液，用大鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，转移至-80 ℃低温冰箱备用。
2.4 脾脏淋巴细胞总蛋白的提取
将标本从低温冰箱中取出，置于研磨管中，加入组织裂解液100 μL(7 mmol/L尿素，2 mmol/L硫脲，100 mmol/L DTT， 5 mmol/L PMSF，4%CHAPS，40 mmol/L Tris)，放入液氮中冷冻成硬块，然后转移到冰台上，反复冻融3次，4 ℃静置1 h后，12 000 r/min离心60 min，取5 μL上清用于2-D Quant Kit 蛋白定量，按试剂盒说明书的方法测定蛋白浓度，余上清冻存于-80 ℃低温冰箱备用。
2.5 双向电泳及考马斯亮蓝染色
采用24 cm IPG trip，上样量为800 μg，具体操作按IPGphor等电聚焦系统指南和Gorg[5]的方法进行。20 ℃水化12 h，行等点聚焦，总电压时间积达64 000 Vh。聚焦后将胶条先后在含DTT和IAA的平衡液中平衡15 min，然后行12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。
2.6 凝胶图谱分析
凝胶通过Immage Scanner扫描仪及Lab Scan扫描软件进行扫描，获取图像；利用PDQuest 7.0分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配等分析。
2.7 质谱分析
选取表达有显著差异的16个蛋白质点，参照文献[6]方法进行。
2.8 数据库查询
采用Matrixscience公司的Mascot软件搜索数据库。肽质量控制在800～4 000 Da，肽片段质量最大误差控制在0.05%，酶解片段不完全选择为1个，物种来源为大鼠，离子选择[M+H]和monoisotopic，半胱氨酸经碘乙酰胺处理(Carbamidomethyl- Cys)，信号峰采用Mascort distiller软件识别。
2.9 统计学方法
采用统计软件SPSS13.0，计量资料用x±s表示，采用t检验；等级计数资料采用Wilcoxon秩和检验；计数资料采用χ2检验。P&<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 一般情况
模型组大鼠较对照组食量减少，体重减轻，毛发干枯，前肢频繁搔头，刺激测咀嚼肌收缩，有时可见口鼻分泌物增加。
3.2 性情变化及旋转时间
模型组在附子汤灌胃3周后，其激惹程度发生了很大的变化，多表现为Ⅱ级，且有4只出现了眼结膜充血(见表1)。表1 2组大鼠性情变化、外观及旋转时间变化比较(略)注：与对照组比较，*P&<0.01
3.3 2组大鼠脾脏淋巴细胞2-DE图谱及差异蛋白质点分析
在相同条件下分别将对照组和模型组脾脏淋巴细胞总蛋白质样品进行3次双向电泳，其总蛋白分布模式非常相似，以pI3～8和Mr14.4～75 kD范围的蛋白质点最多(见图1)。经PDQuest7.0软件分析，相同条件下，识别的蛋白质斑点数分别为对照组(510±19)个，模型组(500±23)个。图像分析时将对照组的一块凝胶选为参考胶，其他凝胶中蛋白质点与其相匹配，结果模型组的平均匹配点数为(433±11)，平均匹配率为85%。模型组与对照组图像分析统计后发现，偏头痛肝阳上亢组与对照组相比有16个蛋白质下调和4个蛋白质上调。见表2。表2 差异蛋白质点在模型组和对照组的表达量（略）
3.4 差异表达蛋白质点的MALDI-TOF-MS质谱鉴定及数据库查询
随机选取图像分析统计后的差异大于2倍的蛋白质点，胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定。共得到13个肽质量指纹图谱，其中3个无质谱结果，10个搜索到具有统计学意义的蛋白质。初步鉴定的蛋白质按功能进行初步分类，主要有以下几种：通道蛋白、抗氧化蛋白、专利蛋白、基本代谢相关蛋白、细胞骨架蛋白和其他类。其中鉴定的蛋白分别为：氯通道蛋白-1、硫氧还蛋白过氧化物酶-Ⅰ、硫氧还蛋白过氧化物酶-Ⅱ、专利蛋白WO979348序列、Rho GDP解离抑制因子α、肌动蛋白2/3复合物、神经微丝轻肽、蛋白酶体、热休克蛋白-27、膜联蛋白-A1。详见表3。表3 用Mascot软件在数据库中收索到的有意义的蛋白（略）注：↓表示该蛋白点在模型组表达下调，↑表示该蛋白点在模型组
表达上调
4 讨论
偏头痛是一种发作性头部功能不稳定与体内某些活性物质暂时性改变引起的一种头痛。偏头痛常见的辨证分型为肝阳上亢型、痰浊上泛型、气血亏虚型和瘀血阻络型。肝阳上亢是主要证型之一，平肝潜阳是治疗偏头痛肝阳上亢型的常用方法，为清代叶天士首创。其在《临证指南医案》中明确指出：“肝为风脏，因精血衰耗，水不涵木，木少滋荣，故肝阳偏亢。”基本病机为肝阴不足，潜降、宁静功能减退，阴不足制阳，结果肝的升、动太过，形成气血上涌，并见躁动不安的病理状态，病理生理基础为外周交感-肾上腺髓质功能偏亢[7]。
蛋白质组是一种新的研究手段，是指由一个基因组、一种生物或一种细胞/组织表达的所有蛋白质[8]。由双向电泳、质谱、计算机图像数据处理组成的蛋白质组学的技术体系具有高通量、高分辨率和高重复性的特点，能对微量样品进行全面自动定量分析，并在疾病诊断物的发现、药物作用靶标、安全性评价、耐药性机制、疾病动物模型研制和中医药现代化等方面得到应用[9]。研究表明，偏头痛患者存在免疫复合物增加，免疫失调[10]。笔者采用蛋白质组学技术比较对照组和偏头痛肝阳上亢证组大鼠淋巴细胞蛋白质表达的差异，下面简单探讨一下部分蛋白质表达的意义。
氯通道蛋白(CIC-1)的功能非常多样，包括保持离子内稳态、细胞体积调节、跨上皮细胞的物质运输、骨骼肌细胞兴奋性的保持、胞内囊泡的酸化等[11-13]。国内研究发现，氯通道阻滞剂DIDS、NPPB对T细胞增殖呈浓度依赖性抑制，阻断氯通道的开放对T淋巴细胞的Ca2+运动有抑制，其表达的下降能影响淋巴细胞的功能[14]。Ricardo等[15]的研究表明，Ca2+在B细胞内升高的幅度和持续时间与一些促炎性转录因子(例如NF-κB)的活化有关。笔者认为，氯通道蛋白的下调，可能引起淋巴细胞内Ca2+内流增多，导致淋巴细胞促炎性因子的释放和淋巴细胞的活化，引起偏头痛的发作。
硫氧还蛋白还原酶属于硫氧还蛋白系统，广泛存在于各种组织中，可以清除自由基，从而对组织起保护作用[16]。国外学者发现偏头痛患者存在NO和SOD紊乱，而氟桂嗪能明显调节过氧化物水平[17]。模型组中硫氧还蛋白还原酶的上调可能是机体的一种自我保护机制。
笔者发现，Rho GDP解离抑制因子α和肌动蛋白2/3复合物在模型组中的表达下降。近年来发现，Rho GDP蛋白亚家族可能参与了淋巴细胞极化和抗原提呈，还通过调节胞浆中的微丝上肌动蛋白的聚合和解离从而影响细胞形态，并可以引起Ca2+的活化[18]。因此，笔者推测，Rho GDP解离抑制因子表达下调导致Rho GDP的过度活化，引起肌动蛋白的聚合，影响细胞的形态，导致了淋巴细胞的活化及Ca2+在细胞内浓度的增高，多重途径参与了偏头痛的发生与发展。
热休克蛋白-27属于小分子热休克蛋白家族，以磷酸化依赖的方式调节细胞骨架肌动蛋白微丝的多聚化，提高细胞抗损伤能力，并参与多种效应反应，可能是在机体抗损伤中起一定作用。Evgrafov等[19]的研究发现，该蛋白的突变与进行性神经性肌萎缩和遗传性运动神经病有关。但这些蛋白在偏头痛肝阳上亢证中的表达意义尚未见文献报道。
总之，这些蛋白可能与偏头痛肝阳上亢证的形成有关，本实验为进一步揭示偏头痛肝阳上亢证的发病机制提供了新的线索。
致谢：本课题承中南大学生殖与干细胞工程研究所及湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组重点实验室的技术支持！
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