作者：张葵，张樱，陈翌江，芦莉
【摘要】 目的 观察参芪补肺汤对肺气虚证慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气道重构中基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织型金属蛋白酶抑制物(TIMPs)蛋白表达的影响。方法 用烟、二氧化硫定量熏吸并复合木瓜蛋白酶雾化吸入法，建立肺气虚证COPD大鼠模型。60只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、补低组、补中组、补高组、激素组。半定量图像分析法测量小气道管壁和平滑肌层厚度；免疫组化法检测支气管肺组织MMP-9、TIMP-1的表达。结果 与正常组比较，模型组MMP-9和TIMP-1蛋白在支气管肺组织中高表达(P&<0.01)，小气道管壁及平滑肌层均显著增厚(P&<0.01)。治疗后，与模型组比较，补高组、补中组和激素组MMP-9蛋白表达显著减少(P&<0.01)，激素组优于中药组(P&<0.01)；补高组、补中组TIMP-1蛋白表达均显著减少(P&<0.01)；补高组管壁及平滑肌层厚度显著降低(P&<0.05)。结论 参芪补肺汤可抑制支气管肺组织MMP-9、TIMP-1蛋白表达，干预肺气虚证COPD大鼠气道重构。
【关键词】 参芪补肺汤；慢性阻塞性肺疾病；肺气虚证；气道重构；基质金属蛋白酶；大鼠
Key words：Shenqi Bufeitang；chronic obstructive pulmonary disease；lung-Qi deficiency syndrome；airway remodeling；metalloproteinase；rat
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全可逆性气流阻塞、气道慢性炎症和气道重构为特征的疾病。基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织型金属蛋白酶抑制物(TIMPs)与气道炎症修复重构密切相关。中医认为肺气虚是COPD发生的首要条件，且贯穿疾病始终。参芪补肺汤从《永类钤方》中的补肺汤化裁而来，是治疗肺气虚证稳定期COPD患者的有效方剂。本研究拟通过观察参芪补肺汤对肺气虚证COPD大鼠肺组织中MMP-9、TIMP-1表达的影响，探讨其干预COPD肺气虚证大鼠气道重构的作用和机制。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重180～200 g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司(合格证号：0052543)。动物饲养室为清洁级，控制温度15～5 ℃。
1.2 药物与试剂
参芪补肺汤(由黄芪30 g、党参15 g、补骨脂10 g、丹参30 g、百部10 g、桑白皮10 g组成)，贵阳中医学院第一附属医院药剂科提供，水煎2次浓缩为含原药材2 g/mL的药液。吸入用布地奈德混悬液，AstraZeneca公司产品，批号300229，购自贵阳医学院附属医院；木瓜蛋白酶，Sigma公司产品；兔抗MMP-9及TIMP-1多抗、即用型SABC免疫组化染色试剂盒均为武汉博士德公司产品；DAB显色试剂盒，北京中山公司产品。
1.3 主要仪器
超声雾化器，德国白瑞公司；自制透明塑料箱40 cm×40 cm×40 cm；RM 2016型轮转式石蜡切片机，上海徕卡仪器有限公司；BX51显微镜，日本Olympus。
2 实验方法
2.1 造模
采用《中医实验动物学》之“肺气虚证动物模型”复制法[1]，并复合木瓜蛋白酶雾化吸入法[2]复制“肺气虚证”稳定期COPD模型大鼠。用刨花、锯末、烟叶各30～50 g，另加二氧化硫粉10 g，点燃烟熏，模型大鼠暴露于烟雾浓度300 ppm的烟室中，每日2次，每次1 h，并于造模开始后第30、32、34、36日将超声波雾化器与40 cm×40 cm×40 cm透明塑料箱相连，通过雾化管向箱中模型大鼠喷入浓度为0.3%的木瓜蛋白酶，每5只大鼠2 mL。造模期60 d。
2.2 分组与给药
Wistar大鼠随机分为6组，每组10只。正常组：置于正常无烟环境中饲养，不予处理。模型组：造模1月后开始生理盐水灌胃10 mL/(kg·d)，同时雾化吸入生理盐水4 mL/d；补高组：造模1月后开始给参芪补肺汤水煎剂灌胃3.52 g/(100 g·d)，相当于成人常规临床用量的4倍，同时雾化吸入生理盐水4 mL/d；补中组：造模1月后开始给参芪补肺汤水煎剂灌胃1.76 g/(100 g·d)，相当于成人常规临床用量的2倍，同时雾化吸入生理盐水4 mL/d；补低组：造模1月后开始给参芪补肺汤水煎剂灌胃0.88 g/(100 g·d)，相当于成人常规临床用量等效量，同时雾化吸入生理盐水4 mL/d；激素组：造模1月后开始雾化吸入布地奈德4 mL/d(0.5 mg/mL)，同时灌服生理盐水10 mL/(kg·d)。以上治疗均每日1次，共30 d。
2.3 观察及检测指标
2.3.1 一般情况
观测大鼠的活动度、对外界反应的灵敏度、皮毛光泽、饮食、饮水、体重、死亡情况。
2.3.2 支气管肺组织形态学观察
大鼠处死后，取左肺上叶置于10%中性福尔马林溶液中固定。酒精梯度脱水，二甲苯透明标本，浸蜡，包埋，切片，HE染色。于光学显微镜下观察组织形态学改变，参照文献[3]用图像分析系统测量小支气管管径、管壁和平滑肌厚度。
2.3.3 基质金属蛋白酶及其组织型金属蛋白酶抑制物蛋白表达检测
按照链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合体(SABC)试剂盒染色步骤：切片常规脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液微波修复，一抗稀释度均为1∶50， DAB显色，苏木素复染，阴性对照以PBS代替一抗，光镜观察。MMP-9、TIMP-1的阳性表达为胞浆内呈棕黄色颗粒样改变。在图像分析系统上，每张切片选取小支气管2根，3个不包含支气管、血管结构的视野，固定光镜倍数观察，应用图像分析软件对MMP-9和TIMP-1的表达进行图像分析，表达强度用平均光密度值(MOD)表示。
2.4 统计学方法
数据用x±s表示，多组间数差异显著性检验采用方差分析，多组间两两比较采用LSD法。数据统计采用SPSS15.0软件处理。
3 结果
3.1 一般情况
正常组活泼好动，皮毛光亮，体形肥胖，强壮，呼吸平稳。模型组逐渐活动量减少，不活泼，拱背蜷卧，毛发稀疏，竖毛，无光泽，食量减少，行动迟缓，撮毛，体弱瘦小，从第20日起开始咳嗽、喷嚏频作，后期呼吸加深、急促，符合肺气虚证的表现[4]。给药组介于空白组、模型组之间。
3.2 支气管形态学测量
(见表1)表1 各组大鼠支气管形态学测量结果比较(略)注：与正常组比较，*P≤0.01；与模型组比较，△P&<0.05；与补高组比较，
▲P&<0.05(下同)
3.3 支气管肺组织中基质金属蛋白酶及其组织型金属蛋白酶抑制物的蛋白表达
(见表2)表2 各组大鼠支气管、肺组织中MMP-9和TIMP-1的蛋白表达比较(略)注：与补高组比较，★P&<0.05
4 讨论
气道重构是COPD气流受限的主要原因。肺细胞外基质(ECM)过度沉积是气道重构的显著特点之一，MMPs及TIMPs是调节ECM降解合成的主要酶类。MMPs是目前所知唯一能使胶原纤维变性降解的酶，其增多可促使肺泡壁基底膜降解及肺气肿形成，TIMPs是内源性抑制MMPs活性的一组多功能因子家族，TIMPs抑制MMPs的活化，促进ECM沉积和抑制其降解，可促使平滑肌细胞、表皮细胞增殖[5]。正常情况下，MMPs与TIMPs处于平衡状态，在炎症状态下，炎性细胞和结构细胞表达MMPs明显增强，随着病程的进展，炎性细胞减少，成纤维细胞增多，成纤维细胞也产生MMPs和TIMPs，且分泌MMPs弱的细胞亚群占优势，并分泌TIMPs增强，加上其它细胞的综合作用，最终导致MMPs/TIMPs比例下降。Vignola等[6]在COPD患者痰中发现，MMP-9/TIMP-1比值低于健康人，这一比值与第1秒钟用力呼气容积呈正相关，表明MMPs/TIMPs失衡与ECM重构及气流阻塞密切相关。研究表明，COPD的发生发展与MMP-9/TIMP-1的不平衡有关[7]。本实验显示，模型组MMP-9、TIMP-1蛋白表达较正常组增高，同时其小支气管管壁和平滑肌厚度也增厚，提示肺气虚证COPD气道重构与MMP-9、TIMP-1的表达增加有关。MMP-9/TIMP-1失衡推进了气道炎症损伤和修复重构。
肺虚卫气不足，卫外不固，呼吸道防御机能和免疫调节能力下降，则易受邪侵而发病。随病情的发展，又常累及他脏，肺病及脾，肺虚及肾，三脏相互作用，其功能失调导致痰瘀的产生。COPD形成并持续发展会进一步加重肺气虚。因此，重视COPD肺气虚证的治疗尤为重要。参芪补肺汤由黄芪、党参、补骨脂、丹参、百部、桑白皮组成。诸药合用，共奏补肺健脾益肾兼化痰活血化瘀之效，而以补肺气为首要。本实验结果表明，补中组、补高组和激素组较模型组MMP-9表达显著减少(P&<0.01)，且激素组优于中药组(P&<0.01)；补中组和补高组较模型组TIMP-1表达显著减少(P&<0.01)，补高组优于补中组(P&<0.05)，激素组无明显作用；补高组较模型组大鼠管壁及平滑肌层厚度显著降低(P&<0.05)，补中组及激素组有降低趋势，但无统计学意义。提示中药可能通过抑制MMP-9和TIMP-1的表达，调节MMP-9/TIMP-1失衡，进而干预气道重构。本实验表明，MMP-9、TIMP-1的表达增加参与了COPD肺气虚证气道重构，中药可干预其发病过程，延缓COPD的发展。
参考文献
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[7] Funada Y， Nishimura Y， Yokoyama M. Imbalance of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 is associated with pulmonary emphysema in Klotho mice[J]. Kobe J Med Sci，2004，50(3/4)：59－67.