作者：韩玉生，周忠光，姜国华
【摘要】 目的 建立多因素损伤老年性痴呆(AD)大鼠模型，探讨补气活血方对AD大鼠血清β淀粉样蛋白(β-AP)、转化生长因子(TGF-α)及类胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)水平的影响及其作用机理。方法 采用腹腔注射D-半乳糖、氢溴酸东莨菪碱注射液(SCOP)，喂饲AlCl3 ，喹啉酸(QA)海马区注射相结合的方法建立多因素损伤AD大鼠模型，随机分为正常组(A组)、假损伤组(B组)、模型组(C组)、补气活血方组(D组)、喜得镇组(E组)。D、E组分别灌胃给予补气活血方和喜得镇，A、B、C组给予等容积的生理盐水。治疗3周后，放免法观测大鼠血清β-AP、TGF-α及IGF-Ⅱ水平变化。结果 模型组大鼠血清β-AP、TGF-α及IGF-Ⅱ水平明显升高，经补气活血方和喜得镇治疗后，血清β-AP、TGF-α及IGF-Ⅱ水平明显降低。结论 补气活血方可能通过调节TGF-α、IGF-Ⅱ的水平，影响β-AP生成，从而达到治疗AD作用。
【关键词】 补气活血方；老年性痴呆；多因素损伤；β淀粉样蛋白；生长因子；大鼠
Key words：Buqi Huoxue Decoction；Alzheimer’s disease；multi-factor injury；β-AP；growth factor；rat
长期以来，对于老年性痴呆(AD)治疗的实验研究多局限于单因素的动物模型，不能充分体现AD与衰老及多种环境因素相关的病理机制。本研究采用多种方法相结合建立多因素损伤AD大鼠模型，用放射免疫分析方法检测模型大鼠血清β淀粉样蛋白(β-AP)、转化生长因子(TGF-α)及类胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的含量，探讨中药补气活血方对其影响及其的作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar大鼠70只，雌雄各半，清洁级，体重(300±20)g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(黑) 20020001。
1.2 药物、试剂与仪器
补气活血方系古方补阳还五汤为基础加减而组成的经验方，由黄芪、党参、当归、茯苓、远志、赤芍、川芎等组成，制成浓缩液(含原药材6.5 g/mL)，黑龙江中医药大学制剂室提供。喜得镇为瑞士山德士药厂与天津华津制药厂联合生产；D-半乳糖由上海试剂二厂生产；氢溴酸东莨菪碱注射液(SCOP)由上海禾丰制药有限公司提供；喹啉酸(QA)，美国Sigma公司产品。脑立体定位仪(SN-ZM，日本)；大鼠跳台仪。
1.3 造模与分组
大鼠适应1周后进行跳台实验，剔除不合格者，称重后随机分成正常组(A组)、假损伤组(B组)、模型组(C组)、补气活血方组(D组)、喜得镇组(E组)，每组15只。除A、B组外，其余各组均予D-半乳糖5O mg/(kg·d)，皮下注射6周，造成亚急性衰老模型[1-2]。C、D、E组同时每日喂饲AlCl3水溶液20 mg/mL×6周，B组予以等量的生理盐水。6周后将QA注入亚急性衰老大鼠海马。具体方法：将大鼠用3%的戊巴比妥钠30 mg/kg经腹腔麻醉后，固定在脑立体定位以上，于颅顶正中切口，钻开颅骨，以微量注射器垂直进针，用0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液溶解的QA 1 μL(含QA 150 nmol/2 μL)缓慢注入两侧海马，B组注入O.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液1 μL，每侧注入时间为5 min，留针时间5 min，局部消毒后，缝合皮肤。最后C、D、E组大鼠于实验观察前15 min前给予腹腔注射SCOP 2 mg/kg，B组给予等量的生理盐水。剔除造模过程中死亡及不成功大鼠，最后每组取10只进行检测。
1.4 给药
D、E组大鼠于注射QA后第1O日开始分别连续灌胃，其余各组予以生理盐水灌服，以上各组均按10 mL/(kg·d)灌胃，连续3周。
1.5 观测指标
1.5.1 大鼠跳台实验
腹腔注射SCOP或生理盐水后进行试验，测试学习能力。将大鼠放入跳台仪内适应环境5 min，然后通电，大多数大鼠跳上跳台逃避电击。从通电到完全稳定上台所用的时间为潜伏期，跳下时大鼠双足同时接触铜栅视为错误反应，训练5 min并记录5 min内的潜伏期和错误次数作为学习指标。24 h后重测，先将大鼠放在跳台上，记录大鼠第1次跳下跳台时间为潜伏期，并记录错误次数作为记忆能力指标。
l.5.2 血清β淀粉样蛋白、转化生长因子及类胰岛素样生长因子Ⅱ水平检测
给药3周后大鼠股动脉取血分离血清，血清β-AP、TGF-α及IGF-Ⅱ检测采用放免法。放免试剂盒由北京福瑞生物工程公司提供。检测由哈尔滨医科大学附属二院同位素室完成。
转贴于1.6 统计学方法
实验数据经SPSS10.0软件统计，组间进行t检验。
2 结果
(见表1、表2)表1 各组大鼠学习、记忆能力的比较(略) 注：与B组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与C组比较，▲P&<0.05，▲▲P&<0.01(下同)
表2 补气活血方对大鼠血清β-AP、TGF-α及IGF-Ⅱ水平的影响（略）
3 讨论
目前的研究进展表明，虽然AD的确切病因尚不十分清楚，但与机体的衰老、某些环境危险因素引起的某些基因突变或先天性基因脆弱有关。理想的AD模型应该考虑上述多病因综合作用，并能模拟出具有AD特征性的脑NFT、P物质及胆碱能系统损害等病理变化[3]。而在亚急性衰老模型的基础上，加入慢性铝中毒、SCOD和QA中毒应能基本满足上述理想模型的条件。本研究采用的模型是在D-半乳糖导致大鼠亚急性中毒而致早衰的基础上，再用慢性铝中毒、SCOD、兴奋性氢基酸受体激动剂QA海马内注射，破坏胆碱能神经元，造成类AD改变，这种模型是结合了AD发病的老化特点及有关的神经生化改变而研制的，表明它是目前可取的AD模型之一。
β-AP是老年斑形成的始动因子，也是老年斑中的重要成分，β-AP的大量沉积是AD病理机制中老年斑形成的核心问题[4]。β-AP水平升高具有神经毒性作用，最后导致神经元的凋亡[5]。脑内胶质细胞是神经元的免疫细胞，可分泌多种细胞生长因子如GF-α及IGF-Ⅱ等。这些生长因子增多时，能刺激轴突生长和神经递质的合成，促进交感神经元增殖，是胶质细胞粘附时诱发神经毒素作用的关键因素，故β-AP在老年斑形成过程中对神经元的毒性作用可能是通过TGF-α和IGF-Ⅱ等生长因子来实现的。本研究结果显示，AD模型组大鼠血清β-AP、TGF-α及IGF-Ⅱ均明显高于假手术组，且后二者含量变化与β-AP均密切相关。提示AD发病病理过程中，β-AP含量变化可能与多肽生长因子有密切关系。
经过治疗，补气活血方组和喜得镇组大鼠血清β-AP水平明显下降，但仍明显高于假手术组。提示补气活血方能有效地降低其血清β-AP水平，可能是通过降低血清TGF-α水平而起作用的，与血清IGF-Ⅱ水平关系明显。这可能是该药改善AD大鼠学习记忆能力的作用机制之一。
【参考文献】
[1] 张 熙，李文彬，张炳烈.D-半乳糖致亚急性中毒大鼠拙衰老生化改变[J].中国药理学与毒理学杂志，1990，4(4)：309－310.
[2] 陈树元，金伟军，陈志良，等.D-半乳糖致大鼠亚急性衰老模型的建立[J].第一军医大学学报，1995，15(3)：233.
[3] 谢 宁，宋琳莉，牛英才，等.老年性痴呆动物模型研究进展及其评价[J].实验动物与比较医学，2006，26(1)：50.
[4] Jung SS， Nalbantoglu J， CashmanNK. Alzheimer’s beta-armamloid precursor protein is expressed on the surface of immediately exvivo brain cell：a flow cytometric study[J]. J Neurosci Res，1996，3：336.
[5] Terry RD. Basis of structural Alzheimer’s disease and some pathogenic concepts[M]. Boston：Biekhanser，1997.235.