作者：区健刚 梁清华 陈疆 曾年菊 熊新贵 萧梅芳 关勇军 鄢东红
【摘要】 ：目的 研究中医肝阳化风证和血虚生风证帕金森病患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)的比较蛋白质组差异。从蛋白表达水平上探讨中医肝阳化风证和血虚生风证的本质。方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离肝阳化风证和血虚生风证帕金森病患者和正常人PBMC总蛋白质，考马斯亮蓝染色，PDQuest 2-DE软件分析，对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱，用Mascot查询系统查询SWISS-PROT数据库。结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳考染图谱，对其中的15个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析，经数据库查询，初步鉴定为一些与细胞骨架、抗氧化应激、蛋白降解、信号转导、细胞周期调控等有关的蛋白质。结论 建立了帕金森病肝阳化风证和血虚生风证PBMC的双向凝胶电泳图谱，提示帕金森病肝阳化风证和血虚生风证患者和正常人的PBMC的蛋白质表达具有差异，这种蛋白质组的差异分析有助于为研究肝阳化风证和血虚生风证本质在蛋白质水平上提供物质基础。
【关键词】 肝阳化风 血虚生风 帕金森病 单个核细胞 双向凝胶电泳 质谱
Abstract：Objective To investigate the comparative proteomes difference of PBMC between health adults and Parkinson Disease (PD) patients with Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome. So to approach the essence of the two TCM syndromes from the protein expression level. Methods A series of methods， including immobilolized pH gradient two-dimensional polyacrylamide gel electrophpresis (2-DE)， Coomassie Brilliant Blue staining， PDQuest 2-DE analysis software， peptide massfingerprint based on matrix-assisted laser desorption/ionization time of flying mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and SWISS-PROT database searching， were used to separate and indentify the proteome of PBMC between health adults and PD patients with Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome. Results The good 2-DE pattern including resolution and reproducibility was obtained. After Coomassie Brilliant Blue staining， 15 spots were incised and analyzed by MALDI-TOF-MS. The typic peptide masses were searched in the SWISS-PROT database by Mascot software. All proteins were preliminarily identified， which ralated to cytoskeleton， anti-oxidative stress， protein degradation， signal transduction and cell cycle， etc. Conclusions The well-resolved， reproducible 2-DE patterns of Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome PD were established and revealed the protein expression difference of PBMC between the two syndromes of PD patients. This research is helpful to provide substance evidence in investigation of the essence of Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome on protein level.
Key words：Ganyang Huafeng syndrome；Xuexu Shengfeng syndrome；Parkinson Disease；PBMC；two-dimensional polyacrylamide gel electrophpresis (2-DE)；mass spectrometry
帕金森病(Parkinson Disease，PD)是中老年常见的第二大神经系统变性疾病，属于中医学“震掉”、“颤振”，甚至“痉病”和“肝风”的范畴，以黑质多巴胺(DA)能神经元变性缺失和路易小体(Lewy body)形成为特征。多数中医学者认为，本病以肝肾不足为本，正虚邪恋，虚实互见，总属本虚标实，病因繁多，病机复杂，是一个多病因、多病机参与的难治病。1991年11月，第三届中华全国中医学会老年脑病学术研讨会通过了《中医老年颤证诊断和疗效评定标准试行草案》(以下简称《草案》)，将老年颤证分为痰热动风、血瘀生风、气血两虚、肝肾不足、阴阳两虚五个证型，为PD的辨证分型提供了有益的借鉴。临床报道中有一些医生在《草案》的基础上又有诸多分型，如血虚生风、肝阳化风等，并依据中医辨证论治的原则，在实践中筛选出许多有效治疗方法和方药[1]。综观多年来中医药治疗PD的医学实践，其疗效是确切的，但也应看到仍存在诸多问题尚待解决。尤其是分型较多，且辨证分型过分强调证与证之间的区别，割裂了证与证之间的联系。
本实验利用双向凝胶电泳技术对PD肝阳化风证和血虚生风证患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)进行比较蛋白质组学研究，获得了较满意的双向电泳(2-DE)图谱，并用PDQuest分析软件对2-DE图谱进行了分析，差异蛋白质点经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定肽质指纹图谱，为进一步研究PD及其辨证提供了实验基础。
1 对象
PD病例选择均符合英国帕金森病脑库临床诊断标准[2]，中医肝阳化风及血虚生风辨证标准参照《中医肝脏象现代研究与临床》中有关标准[3]。30例PD患者均来自2006年3月－2006年7月中南大学湘雅医院神经内科门诊患者。其中肝阳化风证17例，男10例，女7例，年龄36～69岁，平均(56.71±10.93)岁；血虚生风证13例，男7例，女6例，年龄50～65岁，平均(59.23±4.80)岁。正常健康志愿者(对照组)10例，来自同期中南大学湘雅医院健康体检中心，男女各5例，年龄49～65岁，平均(57.30±5.85)岁。各组年龄分布上无差异(P＝0.699)。均排除心、肝、肾等功能不全者，有活动性胃肠病变者，血液及内分泌系统疾病者，过敏体质者，孕期或哺乳期妇女。入选对象均签署知情同意书。患者及正常组每人均抽取10 mL外周静脉血，PBMC的分离参照经典的葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法制备[4]。
2 方法
2.1 固相pH梯度双向凝胶电泳
2.1.1 细胞总蛋白质的制备
参照湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组重点实验室推荐程序制备。每EP管标本(约40～50 mg PBMC)放细胞裂解液50 μL，反复振荡令其充分溶解(10 s/次×8次)，每次间隔10 min，离心(7 500 g×1 h，4 ℃)，吸取上清液即为细胞总蛋白质。取5 μL分装，1.5～2 h后按BCA蛋白质定量试剂盒的微量测试法测定总蛋白质浓度。
2.1.2 双向电泳
主要参照Amersham公司二维凝胶电泳手册进行。IPGpH3-10NL，24 cm，采用胶内泡涨法。将含有1 mg蛋白质的各组蛋白提取液分别与IPG胶条水化液混合，进行一向等电聚焦电泳。电泳参数：30 V 13 h(水化)，依次经100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h、8 000 V &>8 h(8.5 h，68 000 Vh)。等电聚焦结束后，将IPG胶条分别在含有DTT和碘乙酰胺的平衡液中各平衡15 min。将平衡后IPG的胶条移至12.5%的SDS凝胶上端，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳条件：每胶2.5 W/T1恒流电泳30 min后，每胶12 W/T2恒流电泳至溴酚蓝离胶最底缘约1 mm处停止电泳。将凝胶置考马斯亮蓝染色液(G250＋磷酸＋硫酸铵＋甲醇＋DDh3O)中12 h后弃去考染液，双蒸水洗涤2次后，用20%乙醇摇床洗涤脱色至背景清晰后扫描。
2.2 凝胶图像分析
Imagescanner扫描仪扫描考染的凝胶获取图像，用PDQuest 2-DE分析软件进行图像分析。为消除误差，将同组的三张2-DE凝胶拟合成为一张平均胶，然后进行组间比较。以正常组2-DE凝胶为参考胶，PD肝阳化风组和PD血虚生风组与之相互匹配比较，寻找差异蛋白点。
2.3 差异蛋白质点的肽质指纹分析
切下凝胶差异蛋白点，脱色，胶内酶切，检测肽质指纹图(PMF)。Mascot Distiller软件检索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。
3 结果
3.1 差异蛋白质点的MALDI-TOF-MS肽质指纹分析
选取上述15个差异表达蛋白质点经质谱分析得到PMF图谱后，查询SWISS-PROT数据库，全部得到鉴定，共14种非冗余蛋白质，其功能主要与细胞骨架、抗氧化应激、蛋白降解、信号转导、细胞周期调控等有关，具体蛋白及其在各组的变化趋势见表1。表1 正常人及PD肝阳化风证、血虚生风证患者PBMC差异蛋白质鉴定（略）注：蛋白点的变化趋势均以正常组为参照，同一蛋白在不同组的胶图上进行比较，其中↓代表较正常组下调50%；↓↓代表下调75%以上，↓↓↓表示下调90%以上
3.2 双向凝胶电泳考染图谱及差异分析
在相同条件下对来自帕金森病和正常PBMC的总蛋白质样品分别进行了3次双向电泳(n＝3)。其总蛋白质的分布模式非常相似，以pI 4～8和Mr 20～60 kD范围的蛋白质斑点分布最多。经Imagescanner图像采集和PDQuest 2-DE分析软件分析，在相同条件下识别的图像分析探测到正常组PBMC的平均蛋白质点数为(700±30)个，肝阳化风证(602±15)个，血虚生风证(577±28)个，以正常组胶为参考胶进行胶间斑点匹配，其平均匹配点数肝阳化风证组为(552±16)个，平均匹配率为78.8%，血虚生风证组为(494±25)个，平均匹配率为70.6%。不同胶间蛋白质点的位置偏差在IEF方向为(2.85±0.48)mm，在SDS-PAGE方向为(2.69±0.37)mm。以上条件能满足两细胞间的差异蛋白质分析。采用PDQuest软件建立同组内3张2-DE凝胶的平均胶，即计算同组内所有凝胶上的同一蛋白质点的平均表达量，某个蛋白质点的表达量是其在胶上的灰度体积(面积×灰度)。比较3组平均胶的差异(均数进行成组比较的t检验，P&<0.05)，得到的正常组、肝阳化风组、血虚生风组PBMC表达差异大于2倍的蛋白质点共15个。
4 讨论
自Abramsky等于1978年提出免疫学异常可能是PD发病的重要影响因素之一以来[5]，近年来越来越多的研究表明，PD中枢神经变性及黑质，纹状体损伤均与细胞免疫介导的炎症反应密切相关[6-10]。本实验发现PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC的蛋白质总数和一系列蛋白质发生下调，相关功能发生减弱。
4.1 细胞骨架相关蛋白
本实验发现，3个细胞骨架相关蛋白Talin-1、Rho GDP解离抑制因子2、CAP-1在PD肝阳化风证和血虚生风证中均有下调，而且血虚生风证下降更为明显。Talin-1作为肌动蛋白结合蛋白，调节微丝的聚合与解聚。Rho GDP解离抑制因子2则为Rho GDI家族成员，通过结合大量的Rho GTP酶从而调节应力纤维和粘着斑的形成。而基于CAP-1的肌动蛋白丝循环是细胞运动性的主要驱动力[11]，对于细胞的发育及形态学过程，运动、内吞及囊泡运输发挥重要作用[12]。此结果提示，在PD病理过程中发生了单个核细胞的激活以及其阿米巴运动和吞噬运动的减弱。而在PD血虚生风证中这种减弱较PD肝阳化风证更为显著。
4.2 泛素蛋白酶系
泛素蛋白酶体系统(UPS)是体内蛋白降解的重要通路。许多研究表明，PD以及其他神经变性疾病可能是一类蛋白降解障碍疾病。F-box protein 4是SCF型E3泛素连接酶复合物底物识别组件，介导蛋白质降解，从而影响如细胞周期、信号传导和基因表达等一系列功能。本实验发现，PD患者PBMC中F-box protein 4下调，血虚生风证较肝阳化风证进一步下调。推测肝阳化风证与血虚生风证与泛素蛋白酶体系统(UPS)功能障碍存在联系。
4.3 抗氧化应激酶系
氧化应激学说认为，多巴胺氧化代谢产物造成的胞内氧化压力过盛和细胞抗氧化能力不足是PD黑质多巴胺能神经元自发退变的主要原因。硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶(Peroxiredoxin Ⅲ，PrxⅢ)属于抗氧化蛋白Peroxiredoxin超家族，该蛋白定位于线粒体，调节细胞氧化还原，通过分生基团保护敏感酶避免氧化损伤。本实验发现，PrxⅢ在PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC中依次表达下调，揭示肝阳化风证和血虚生风证与PrxⅢ下降导致的氧化应激功能减弱有关。
4.4 信号转导相关蛋白
不均一核糖核酸蛋白K(hnRNP-K)是一种核酸结合蛋白，能够结合细胞核及线粒体的前信使RNA及单链DNA，作为一个转录因子在信号转导、转录调节及细胞周期调节发挥作用，并影响线粒体的基因表达及功能。
Transgelin-2属于钙结合蛋白家族，以前仅在平滑肌细胞中研究较多，在淋巴细胞中很少报道。最近，Rubén Francés等发现，在腹膜B1细胞和被刺激的脾脏B2细胞中表达，并推测其作用机制为通过限制肌动蛋白的解聚作用从而调整BCR信号传导来激活该类细胞[13]。我们研究发现，hnRNP-K和Transgelin-2在PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC中表达下调，血虚生风证中下降更为明显，提示在肝阳化风和血虚生风证中发生了细胞信号转导障碍。
4.5 Ras相关蛋白
另外，本实验发现，Rap1b蛋白和Ras抑制蛋白1(Rsu-1)两种Ras相关蛋白在PD肝阳化风证和血虚生风证中表达相继下降，Rap1b蛋白定位于细胞膜、脂锚、细胞质侧，是RAP1的主要异构体[14]。很多研究表明，Rap信号能够调整多种细胞过程包括细胞分化和粘附。而Ras抑制蛋白1(Rsu-1)在真核生物中的各种细胞和组织中广泛存在，作用于Ras 信号传导途径。Masuelli L等[15]研究提示，Rsu-1能够通过Ras途径激活神经生长因子，加速细胞分化。两种Ras相关蛋白在PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC中表达相继下调，表明两证的发生与Ras相关的细胞分化障碍有关。
4.6 多功能蛋白酶
磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP-1)是一种高度保守的丝氨酸蛋白酶抑制剂，在各种组织特别是神经组织中广泛存在。有学者发现，hPEBP家族中的hPEBP4通过抑制MAPK途径的活化[16]及磷脂酰乙醇胺的分泌从而对抗TNF-α诱导的细胞凋亡[17]。PEBP的N端片断能够转化为海马胆碱能神经刺激肽HCNP，可能涉及到中枢海马区的发育成熟和中枢神经系统的突触前胆碱能神经元的功能[18]。Cyclophilin A是一种普遍存在且含量丰富的胞溶质蛋白，系免疫抑制剂环胞霉素A的作用靶，具有肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPIase)活性，保证蛋白质的正确的空间折叠。一直以来，人们对于PPIase的研究主要集中在其介导的免疫抑制作用。但Gold[19]发现，同样具有PPIase活性的FKBP12在神经系统中的含量比在免疫系统中要高出50倍以上，其介导的FK506在体内外均可以促进神经再生。另有学者认为，Cyclophilin A是一种氧化应激诱导分泌的生长因子[20]。本实验发现，PD患者PBMC中PEBP-1和Cyclophilin A这两种抗凋亡和促进细胞生长的蛋白表达下降与帕金森病的神经退行性变是否存在联系值得进一步的探讨，对肝阳化风证和血虚生风证的本质有提示作用。
综上所述，PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC中蛋白质数目下降和相关蛋白表达的改变导致PBMC的阿米巴运动和吞噬运动、抗氧化应激、蛋白降解、信号转导、生长分化、抗凋亡等功能均发生了不同程度的减弱，且PD血虚生风证下降较肝阳化风证更为显著。中医理论认为，肝阳化风和血虚生风同属肝风内动，其根本病机为肝肾阴虚，阴不制阳则阳亢化风，久病也可由肝血亏虚而诱发肝风内动，两者之别在于肝阳化风证为虚中夹实，血虚生风证则为虚中之虚。结合本实验，我们认为，肝肾阴虚肝风内动则PBMC相关功能发生减弱，肝阳化风证虚中挟实，PBMC功能减弱并不显著，机体尚能调节自身正气；久病机体正气愈伤，生血虚生风证为虚中之虚，PBMC功能进一步减退。研究结果在蛋白质水平上支持两证上述中医理论，为两者病机的联系及区别提供了物质基础。
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