作者：古海锋，张小茜，常增荣，傅欣彤，郭洪祝
【摘要】 目的 建立复方益肝灵片中水飞蓟宾的含量测定方法。方法 采用HPLC法；流动相：甲醇-水-冰醋酸(48∶52∶1)；检测波长：286 nm。结果 水飞蓟宾在0.238 0～2.380 μg范围内线性关系良好，其回归方程为：Y＝2.146×106X＋1.818×103，r＝0.999 9，平均加样回收率为98.17%，RSD＝1.3%。结论 该方法简单、准确、重复性好，可作为复方益肝灵片的质量控制方法。
【关键词】 高效液相色谱法；复方益肝灵片；水飞蓟宾
Determination of Silybin in Fufang Yiganling Tablet by HPLC GU Hai-feng， ZHANG Xiao-qian， CHANG Zeng-rong， et al Beijing Institute for Drug Control， Beijing 100035， China Abstract：Objective To establish a method for the determination of silybin in Fufang Yiganling tablet. Methods RP-HPLC was used and the mobile phase was consisted of methanol-water-glacial acetic acid (48∶52∶1). The detection wavelength was 286 nm. Results The calibration curve of Silybin was linear in the range of 0.238 0～2.380 μg， linear equation：Y＝2.146×106X＋1.818×103， r＝0.999 9， with average recovery of 98.17% (RSD＝1.3%). Conclusions The method is simple， accurate and with good reproducibility. It can be used to control the quality of silybin in Fufang Yiganling tablet. Key words：HPLC；Fufang Yiganling tablet；Silybin 复方益肝灵片由水飞蓟素、五仁醇浸膏加工而成，具有益肝滋肾、解毒祛湿等作用，为临床治疗急慢性肝炎的常用药。其中水飞蓟素的主要成分是水飞蓟宾，水飞蓟宾有两种异构体：水飞蓟宾A(silybin A)、水飞蓟宾B(silybin B)[1]。原质量标准收载于《卫生部药品标准?中药成方制剂》(第12册)，其含量测定方法采用UV法测定水飞蓟素含量(以水飞蓟宾计)，对于控制产品质量具有一定作用，但方法专属性不强。本试验建立了HPLC法测定复方益肝灵片中水飞蓟宾含量的方法，该方法简便、准确、重现性好，可作为该制剂的质量控制方法。
1 仪器与试药
岛津LC-20A高效液相色谱仪(SPD-M20A检测器)。水飞蓟宾购自中国药品生物制品检定所(供含量测定用，批号0856- 200203)。复方益肝灵片由北京双鹤现代医药技术有限责任公司提供，批号070304、070308、070311。甲醇，HPLC专用，LANSCAN LTD.出品。冰醋酸，北京现代东方精细化学品有限公司出品，批号20061023。水为纯水机净化水(纯水机型号Millipore Milli-Q biocel型纯水器)。其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备和测定 2.1.1 色谱条件及系统适应性试验
色谱柱为十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，型号SHISEIDO CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇-水-冰醋酸(48∶52∶1)，流速：1.0 mL/min，检测波长：286 nm，柱温：40.0 ℃。分离度(R)：大于1.5，色谱柱的理论板数按水飞蓟宾峰计算，应不低于3 000。色谱图见图1。
2.1.2 对照品溶液的制备
精密称取水飞蓟宾对照品12 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1 mL中含水飞蓟宾120 μg)。
2.1.3 供试品溶液的制备
取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，取0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加75%甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，取出，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。
2.1.4 阴性空白溶液的制备
按处方比例，取不含水飞蓟素的样品0.3 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法操作，制备阴性空白溶液。
2.1.5 测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以水飞蓟宾两个峰面积之和计算，即得。
2.2 方法学考察及结果
2.2.1 线性关系考察
精密量取水飞蓟宾对照品溶液(119.0 μg/mL)，分别进样2.0、4.0、6.0、10.0、20.0 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以水飞蓟宾对照品进样量为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：Y＝2.146×106X＋1.818×103，r＝0.999 9。结果表明，水飞蓟宾对照品在0.238 0～2.380 μg范围内线性关系良好。
2.2.2 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液(批号070304)，分别于配制后0、1、4、8、15、24 h进样10 μL，依法测定。结果RSD＝0.66%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.2.3 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液(批号070304)，按供试品溶液制备方法制备，进样10 μL，重复进样5次，求得RSD＝0.09%。
2.2.4 重复性试验
按“2.1.3”项下方法制备，对同一批样品(批号070304)6份进行测定，求得RSD＝1.0%。
2.2.5 回收率试验
采用加样回收法。精密称取已知含量的同一批号的样品(批号为070304，含量为17.50 mg/g)0.15 g，精密加入水飞蓟宾对照品(0.056 34 mg/mL)的75%甲醇溶液50 mL，按“2.1.3”项下方法制备及“2.1.1”项下色谱条件及系统适应性试验测定，计算回收率。结果见表1。表1 复方益肝灵片中水飞蓟宾加样回收率试验结果（略）
2.2.6 样品测定结果
精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液和“2.1.3”项下供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定3批样品(批号070304、070308、070311)，结果见表2。表2 样品中水飞蓟宾含量测定结果（略）
2.2.7 阴性空白试验
精密吸取“2.1.4”项下的阴性空白溶液10 μL，注入液相色谱仪，结果空白溶液在与水飞蓟宾对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为无干扰。
3 讨论
3.1 流动相的选择
根据文献，流动相曾采用甲醇-水-0.5 mol/L磷酸二氢钾溶液(10∶10∶1[2]、26∶24∶2.5)[3]、甲醇-水(45∶55)[4]、甲醇-水-乙腈-磷酸(45∶50∶5∶0.5[5]、44.5∶50∶5∶0.3)[6]，结果采用甲醇-水-冰醋酸(48∶52∶1)[7]流动相分离效果最好。
3.2 检测波长的选择
取水飞蓟宾对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，用二极管阵列检测器在200～400 nm波长范围检测，结果在286 nm波长处有最大吸收，故采用286 nm作为检测波长。
3.3 提取溶剂的选择
以不同含量的甲醇、乙醇为溶剂，采用加热回流及甲醇超声处理30 min的提取方法，测定同批样品(070304)，结果表明，采用75%甲醇为溶剂，提取较完全。以75%甲醇为溶剂，分别加热回流15、20、30、60 min，测定同批样品(070304)，结果表明，采用75%甲醇加热回流30 min为宜，提取较完全。
3.4 耐用性
取另外两种不同品牌色谱柱，按“2.1.1”项下方法进行试验。分别依法分离测定，结果均能获得满意的分离效果。色谱柱型号：①Phenomenex Gemini C18 110A(5 μm，4.6 mm×250 mm)；②Alltech Alltima HP C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)。
本方法简便、准确、重复性好，可作为复方益肝灵片的质量控制方法。
【参考文献】
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