作者：宋小鸽 张垚 朱永磊 刘先华
【摘要】 ：目的 探讨电针改善吗啡戒断症状的作用机制。方法 建立自然吗啡戒断大鼠模型，运用RT-PCR方法测定脑组织μ受体mRNA的表达，观察电针足三里对吗啡戒断大鼠体重及μ受体mRNA表达的影响。结果 电针组大鼠体重比戒断组增加明显(P&<0.05)，戒断组和电针组比正常组脑组织中μ受体mRNA表达降低，治疗后电针组比戒断组脑组织中μ受体mRNA表达明显增加。结论 电针足三里具有提高吗啡戒断大鼠体重、改善大鼠吗啡戒断症状的作用。电针调节吗啡戒断大鼠海马、下丘脑μ受体mRNA的表达，可能是电针改善大鼠吗啡戒断症状的作用机制之一。
【关键词】 电针 足三里 吗啡戒断大鼠 μ受体mRNA
Abstract：Objective To research the mechanism of electroacupuncture (EA) improving morphine abstinence syndrome in rats. Methods The model of the rat with physical morphine abstinence syndrome was established. The expression of μ-opioid receptor mRNA in the brain tissue of morphine withdrawal rats was examined by RT-PCR， and effects of EA at Zusanli (ST36) on the body weight and expression of μ-opioid receptor mRNA of morphine withdrawal rat were observed. Results The body weight of the EA group was increased compared with the morphine abstinence group (P&<0.05). Comparing with the control group， the expression of μ-opioid receptor mRNA in the brain was lower in the EA group and the morphine abstinence group. After EA， the expression of μ-opioid receptor mRNA of the EA group was more increased than the morphine abstinence group. Conclusion EA at Zusanli (ST-36) can increase body weight of morphine withdrawal rats， and improve morphine abstinence syndrome. EA can increase expression of μ-opioid receptor mRNA in hippolcapal and hypothalamus of brain tissue in morphine withdrawal rat， that may be one of the mechanisms of EA improving morphine abstinence syndrome of rats.
Key words：electroacupuncture；Zusanli；morphine withdrawal rat；μ-opioid receptor mRNA
有研究报道，大鼠在吗啡依赖、戒断过程中额叶皮质、海马、丘脑等μ受体出现明显下调，显著低于正常组水平，并认为μ受体下调是阿片类依赖和戒断的重要神经生物学机制之一[1]。为了进一步探讨针刺改善戒断症状的作用机制，我们在以往研究的基础上，运用RT-PCR方法测定脑组织μ受体mRNA的表达，在观察电针足三里对吗啡戒断大鼠体重影响的同时，探讨电针对海马、下丘脑μ受体mRNA表达的调节作用。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
PCR仪(德国产)；台式高速冷冻离心机(美国产)；电泳及转印系统(瑞典Amersham)；凝胶成像系统(美国伯乐)。盐酸吗啡由沈阳第一制药厂提供，批号000606；RT-PCR试剂盒购自基Promega公司，dntp、Taq酶购自Sangon公司。
1.2 动物
健康SD大鼠24只，雌雄各半，体重180～200 g，安徽医科大学实验动物中心提供。
1.3 造模
连续递增给予大鼠注射吗啡20 d，第1天皮下注射5 mg/kg，从第2天起，每天吗啡剂量增加5 mg/kg(每天上、下午各1次)，第20天的给药量达100 mg/kg，造成吗啡依赖大鼠模型，于实验第21天停药，大鼠出现戒断症状，造成自然吗啡戒断大鼠模型。
1.4 分组
将实验大鼠分为正常组、戒断组、电针组，每组8只，雌雄各半。正常组：皮下注射注射用水0.5 mL，每天1次，连续20 d，常规饲养观察7 d；戒断组：造模后不予任何治疗，常规饲养观察7 d；电针组：造模后，于实验第21天给予电针双侧足三里(PCE-88A型程控电针仪，采用2 Hz和100 Hz交替)，每天1次，每次30 min，连续治疗7 d。
1.5 观察指标
1.5.1 体重
在造模前及造模结束后4、12、24 h和电针治疗后，进行大鼠体重的测量。
1.5.2 μ受体mRNA表达
运用半定量RT-PCR方法测定丘脑和海马μ受体mRNA的表达。
引物由Sangon公司合成，μ受体两条引物序列为：上游引物：5’ACC TGG CTC CTG GCT CAA CTT 3’；下游引物：5’TGG ACC CCT GCC TGT ATT TTG 3’；β-actin上游引物：5’ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC 3’；β-actin下游引物：5’AAG AGA GCC TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA 3’。
总提取RNA，逆转录：大鼠脱臼处死，浸泡在75%酒精中10 min。在消毒室内断头取脑。迅速分离丘脑和海马，各取100 mg，消毒、碾碎；加Tizzol 1 mL；加氯仿0.2 mL；4 ℃，离心15 min；转上层水相于另一1.5 mL EP管中；加等体积异丙醇，混匀，室温10 min；再4 ℃，离心10 min；弃上清，加冰预冷的75%乙醇1 mL；4 ℃，离心5 min；弃上清，空气干燥5～10 min；溶于DEPC水中，70 ℃，水浴10 min，立即置冰上。加入反应体系后，室温放10 min；42 ℃，水浴60 min；95℃、水浴5 min， -20 ℃保存备用。
PCR反应：取适量逆转录反应液，分别进行μ受体和β- actin的PCR扩增。PCR反应液总体积为25 μL。条件为94 ℃变性5 min后进行PCR循环，94 ℃变形30 s，58 ℃退火50 s， 72 ℃延伸30 s，完成30个循环，置-20 ℃保存。取10 μL PCR产物，1%琼脂糖凝胶上电泳，运用凝胶成像系统进行成像摄影。
【摘要】 ：目的 探讨电针改善吗啡戒断症状的作用机制。方法 建立自然吗啡戒断大鼠模型，运用RT-PCR方法测定脑组织μ受体mRNA的表达，观察电针足三里对吗啡戒断大鼠体重及μ受体mRNA表达的影响。结果 电针组大鼠体重比戒断组增加明显(P&<0.05)，戒断组和电针组比正常组脑组织中μ受体mRNA表达降低，治疗后电针组比戒断组脑组织中μ受体mRNA表达明显增加。结论 电针足三里具有提高吗啡戒断大鼠体重、改善大鼠吗啡戒断症状的作用。电针调节吗啡戒断大鼠海马、下丘脑μ受体mRNA的表达，可能是电针改善大鼠吗啡戒断症状的作用机制之一。
【关键词】 电针 足三里 吗啡戒断大鼠 μ受体mRNA
Effects of Electroacupuncture on Expression of μ-opioid Receptor mRNA of Morphine Withdrawal Rat
SONG Xiao-ge， ZHANG Yao， ZHU Yong-lei， et al
Institute of Acu-moxibustion， Anhui College of TCM， Hefei 230038， China
Abstract：Objective To research the mechanism of electroacupuncture (EA) improving morphine abstinence syndrome in rats. Methods The model of the rat with physical morphine abstinence syndrome was established. The expression of μ-opioid receptor mRNA in the brain tissue of morphine withdrawal rats was examined by RT-PCR， and effects of EA at Zusanli (ST36) on the body weight and expression of μ-opioid receptor mRNA of morphine withdrawal rat were observed. Results The body weight of the EA group was increased compared with the morphine abstinence group (P&<0.05). Comparing with the control group， the expression of μ-opioid receptor mRNA in the brain was lower in the EA group and the morphine abstinence group. After EA， the expression of μ-opioid receptor mRNA of the EA group was more increased than the morphine abstinence group. Conclusion EA at Zusanli (ST-36) can increase body weight of morphine withdrawal rats， and improve morphine abstinence syndrome. EA can increase expression of μ-opioid receptor mRNA in hippolcapal and hypothalamus of brain tissue in morphine withdrawal rat， that may be one of the mechanisms of EA improving morphine abstinence syndrome of rats.
Key words：electroacupuncture；Zusanli；morphine withdrawal rat；μ-opioid receptor mRNA
有研究报道，大鼠在吗啡依赖、戒断过程中额叶皮质、海马、丘脑等μ受体出现明显下调，显著低于正常组水平，并认为μ受体下调是阿片类依赖和戒断的重要神经生物学机制之一[1]。为了进一步探讨针刺改善戒断症状的作用机制，我们在以往研究的基础上，运用RT-PCR方法测定脑组织μ受体mRNA的表达，在观察电针足三里对吗啡戒断大鼠体重影响的同时，探讨电针对海马、下丘脑μ受体mRNA表达的调节作用。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
PCR仪(德国产)；台式高速冷冻离心机(美国产)；电泳及转印系统(瑞典Amersham)；凝胶成像系统(美国伯乐)。盐酸吗啡由沈阳第一制药厂提供，批号000606；RT-PCR试剂盒购自基Promega公司，dntp、Taq酶购自Sangon公司。
1.2 动物
健康SD大鼠24只，雌雄各半，体重180～200 g，安徽医科大学实验动物中心提供。
1.3 造模
连续递增给予大鼠注射吗啡20 d，第1天皮下注射5 mg/kg，从第2天起，每天吗啡剂量增加5 mg/kg(每天上、下午各1次)，第20天的给药量达100 mg/kg，造成吗啡依赖大鼠模型，于实验第21天停药，大鼠出现戒断症状，造成自然吗啡戒断大鼠模型。
1.4 分组
将实验大鼠分为正常组、戒断组、电针组，每组8只，雌雄各半。正常组：皮下注射注射用水0.5 mL，每天1次，连续20 d，常规饲养观察7 d；戒断组：造模后不予任何治疗，常规饲养观察7 d；电针组：造模后，于实验第21天给予电针双侧足三里(PCE-88A型程控电针仪，采用2 Hz和100 Hz交替)，每天1次，每次30 min，连续治疗7 d。
1.5 观察指标
1.5.1 体重
在造模前及造模结束后4、12、24 h和电针治疗后，进行大鼠体重的测量。
1.5.2 μ受体mRNA表达
运用半定量RT-PCR方法测定丘脑和海马μ受体mRNA的表达。
引物由Sangon公司合成，μ受体两条引物序列为：上游引物：5’ACC TGG CTC CTG GCT CAA CTT 3’；下游引物：5’TGG ACC CCT GCC TGT ATT TTG 3’；β-actin上游引物：5’ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC 3’；β-actin下游引物：5’AAG AGA GCC TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA 3’。
总提取RNA，逆转录：大鼠脱臼处死，浸泡在75%酒精中10 min。在消毒室内断头取脑。迅速分离丘脑和海马，各取100 mg，消毒、碾碎；加Tizzol 1 mL；加氯仿0.2 mL；4 ℃，离心15 min；转上层水相于另一1.5 mL EP管中；加等体积异丙醇，混匀，室温10 min；再4 ℃，离心10 min；弃上清，加冰预冷的75%乙醇1 mL；4 ℃，离心5 min；弃上清，空气干燥5～10 min；溶于DEPC水中，70 ℃，水浴10 min，立即置冰上。加入反应体系后，室温放10 min；42 ℃，水浴60 min；95℃、水浴5 min， -20 ℃保存备用。
PCR反应：取适量逆转录反应液，分别进行μ受体和β- actin的PCR扩增。PCR反应液总体积为25 μL。条件为94 ℃变性5 min后进行PCR循环，94 ℃变形30 s，58 ℃退火50 s， 72 ℃延伸30 s，完成30个循环，置-20 ℃保存。取10 μL PCR产物，1%琼脂糖凝胶上电泳，运用凝胶成像系统进行成像摄影。
1.6 统计学方法
实验数据采用x±s表示，组间差异性比较用t检验，方差分析，所有统计数据均用SPSS 11.0统计软件分析。
2 结果
2.1 各组大鼠体重比较
(见表1)表1 各组大鼠体重比较(略)注：与正常组比较，*P&<0.01；与戒断组比较，★P&<0.05
2.2 μ受体mRNA表达
β-actin mRNA和μ受体mRNA扩增片段在凝胶电泳中分别位于400～500 bp和500～600 bp之间，证明扩增片段为目的基因。戒断组在500～600 bp处信号弱，条带不明显，表明μ受体扩增产物少，μ受体mRNA表达降低。电针组在此处条带较强，但是还不能达到正常组水平，表明μ受体扩增产物高于戒断组，μ受体mRNA表达较戒断组增高。结果见图1。
3 讨论
在针灸戒毒的实验研究中，常取足三里，因为足三里是足阳明胃经的下合穴，具有健脾和胃、调理气血、通经活络、扶正培元的治疗作用。中医认为，人体的生长发育都要依赖体内的“精气”，而精气分先天之精(藏于肾脏，来源于先天)和后天之精(来源于肺和脾胃)。脾胃为后天之本、气血生化之源，足阳明胃经和脾胃直接相关，足三里是健脾和胃、补益后天的要穴，亦称为“强壮穴”。吗啡属阿片类药物，该类药物最容易耗阴液，损阳气，伤气血；长久吸食则成瘾，最终导致元气耗竭，脏腑俱损。电针足三里可使脾胃脏腑得健，气血生化有源，气血阴阳平衡，起到扶正祛邪的治疗目的。
本实验结果表明，突然停止给予大鼠吗啡后，会产生各种戒断症状包括体重降低，戒断反应对机体是一种强烈的伤害刺激，导致应激反应出现，使机体大量耗能、体质量减轻；电针足三里通过健脾和胃、调理气血、通经活络、扶正祛邪， 使全身各系统之间趋向平衡，维持内环境的稳定，有效地减弱戒断反应的发生，促进体重恢复。
μ受体广泛分布中枢神经系统，μ受体与内啡肽、吗啡结合的特异性很高，可产生欣快、满足感，目前认为药物依赖性的产生主要与μ受体和δ受体相关。本实验结果提示，电针足三里可使吗啡戒断大鼠海马、下丘脑内μ受体mRNA表达上调，这对内源性阿片肽系统恢复有利。结合我们以往的研究及相关资料[2-3]，认为电针足三里可激发经气，经上传至中枢，促进释放β-EP，调节μ受体mRNA表达的上调，将有利于β-EP与μ受体结合，有效发挥β-EP和μ受体的生物学效应，起到调节气血、平衡阴阳、扶正培元、改善戒断症状、促进机体康复的作用。
综上所述，电针足三里有促进吗啡戒断大鼠体重增加、促使μ受体mRNA表达上调的作用，其中电针对μ受体mRNA表达的调节，可能是电针改善戒断症状、促进机体康复的作用机制之一。
【参考文献】
[1] 傅 强，王新华，陈 杞，等.吗啡依赖与戒断大鼠脑组织μ阿片受体的变化[J].中国疼痛医学杂志，2001，7(3)：165.
[2] 宋小鸽，唐照亮，章复清，等.针刺对吗啡戒断大鼠祛毒扶正作用的实验研究[J].针刺研究，2000，25(3)：211.
[3]宋小鸽，唐照亮，章复清，等.电针对吗啡戒断大鼠β-EP免疫调节作用的影响[J].针刺研究，2001，26(4)：303－306.