作者：韦嵩 劳绍贤 黄志新 刘正 胡斌 王健华
【摘要】 ：目的 探讨湿热因素对大鼠胃黏膜水通道蛋白(AQP)3、4基因表达的影响。方法 30只大鼠随机分成3组，造模20 d。对照组正常喂饲；脾虚组隔日喂饲，非喂饲日灌喂番泻叶水煎液；模型组20%蜂蜜水自由饮用，隔日灌服油脂，造模开始后第16～20日每日20时～次日8时将大鼠置入人工气候箱中，造模结束后，采用FQ-PCR方法测定各组胃黏膜AQP3、AQP4基因表达。结果 模型大鼠在造模过程中出现湿热证的特征性表现；模型组AQP3、AQP4基因表达水平高于对照组、脾虚组(P&<0.05)。结论 通过对大鼠施加内、外湿因素的造模方法可复制出湿热证的证候特征；AQP3的异常表达可能是湿热证的发生机制之一。
【关键词】 湿热证 水通道蛋白 动物模型 胃黏膜
Abstract：Objective To establish the animal model of damp-heat syndrome (DHS) and explore the expression of aquaporin (AQP) 3， 4 gene in gastric mucosa. Methods Thirty SD rats were randomized into 3 groups and observed for 20 days. Group A (normal group， NG) was fed with routine method. Group B (Pi deficiency syndrome group， PDS) was fed alternatively with routine method and aqua of cassia angustifolia Vahl. Group C (DHS) was fed with fat， honey liquid and treated with damp-heat environment. The expression of AQP 3， 4 gene in the 3 groups were determined by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR). Results The symptoms and signs in Group C were simiar to the clinical DHS. Expression of AQP3 gene in DHS was statistically significant higher than that in PDS and NG (P&<0.05). Conclusion The method of feeding fat and honey under damp-heat environment is effective to copy DHS. Abnormal expression of AQP3 gene maybe one of the DHS pathogenesis.
Key words：damp-heat syndrome；aquaporin；animal model；gastric mucosa
通过对模型大鼠施加内湿、外湿因素的方法复制湿热证动物模型，模拟出临床湿热证的主要证候；通过测定模型大鼠胃黏膜水通道蛋白(AQP)3、4基因表达，探讨AQP在湿热证发病机制中的作用。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体重(180±20)g，广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：粤检证字2004A014号。
1.2 药物及试剂
番泻叶100 g，制备成1 g/mL水煎剂，4 ℃冰箱保存备用。TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)；琼脂糖凝胶Agarose(美因Sigma公司)；Taq DNA Polymerase(广州中山大学达安基因诊断中心)；MMLV逆转录酶(广州中山大学达安基因诊断中心)；dNTPs(上海华美生化试剂有限公司)；DEPC(美因Sigma公司)；逆转录buffer(德国Qiagen 公司)；定量PCR buffer试剂盒(美国ABI公司)。
1.3 仪器
LRH-800-GS人工气候箱为广东省医疗器械厂产品；YC-DZOZ亚都超声加湿器为北京亚都科技股份有限公司产品。人工气候箱温度设定(32±2)℃，相对湿度设定95%。RCR测定主要设备：PE7000全自动荧光定量PCR仪(美国Perkin Elmer公司)；PE9600PCR基因扩增仪(美国Perkin Elmer公司)；UNIVERSAL 16R低温离心机(美国Hettich公司)；PCA-300多用垂直电泳仪(美国BIO-RAD公司)；UV mini1240紫外分光光度仪(日本SHIMADZU公司)；ABI 3900台式高通量DNA合成仪(美国Perkin Elmer公司)。
2 实验方法
2.1 分组
SD大鼠30只，雌雄各半，分笼适应性喂养3 d后，随机分为3组，即正常对照组(对照组)、脾虚证组(脾虚组)、湿热证组(模型组)，每组10只。
2.2 造模
对照组正常喂饲20 d；脾虚组隔日喂饲，非喂饲日灌喂番泻叶水煎液1 mL/100 g体重，喂饲日饲料量不限，造模20 d。模型组20%蜂蜜水自由饮用，隔日灌服油脂1 g/100 g体重，造模开始后第16～20日每日20时～次日8时将大鼠置入人工气候箱中，造模20 d。
2.3 标本采集处理
实验结束，禁食12 h后以乌拉坦腹腔注射麻醉，颈椎脱臼处死，心脏采血，剖腹，沿胃大弯侧剪开鼠胃，取胃体、胃窦组织黏膜各约0.5 cm×0.5 cm二块，-80 ℃冰箱保存。
2.4 观察指标及检测方法
观察大鼠外观、精神状态及食量、饮水量、体重、粪便，每日测大鼠体重、进食量、饮水量；