作者：陈奕芝，方永奇，梁 毅，王绮雯，何玉萍
【摘要】 目的 研究β-细辛醚对谷氨酸所诱导的PC12细胞损伤的保护作用，并探讨其作用机理。方法 用谷氨酸造成PC12细胞损伤模型，观察β-细辛醚对其细胞形态、损伤程度、存活力、钙离子浓度和细胞凋亡的影响。结果 10 mmol/L谷氨酸作用PC12细胞16 h，出现明显损伤，凋亡率和死亡率升高，培养上清液中LDH含量增加；7.5、15、30 μg/mLβ-细辛醚可有效改善谷氨酸损伤引起的PC12细胞形态改变，提高细胞存活力，减少乳酸脱氢酶渗漏；15、30 μg/mLβ-细辛醚能明显降低谷氨酸引起的PC12细胞内钙离子浓度和细胞凋亡率。结论 β-细辛醚对谷氨酸所致PC12细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能与钙拮抗作用有关。
【关键词】 PC12细胞；谷氨酸；钙；β-细辛醚
Abstract：Objective To study the protective effects of β-asarone on PC12 cells damage induced by Glutamate. Method The effects of β-asarone on PC12 cells after Glutamate intoxication on morphology， extent of damage， livability， intracellular calcium concentration and apoptosis ratio were observed. Result Morphological changes， LDH leakage and intracellular calcium concentration increasing， and cell survival decreasing were observed in PC12 cells exposured to Glutamate. 7.5， 15， 30 μg/mLβ-asarone can increase cell survival， decrease LDH leakage. 15， 30 μg/mL β-asarone can reduce intracellular calcium concentration and apoptosis ratio. Conclusion β-asarone prevents the toxicity of Glutamate， and it maybe attribute to its effect of anticalcium.
Key words：PC12 cells；Glutamate；Ca2+；β-asarone
本实验采用体外培养PC12细胞方法，用谷氨酸(Glu)造成损伤模型，观察β-细辛醚对PC12细胞形态学、细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞内游离钙和细胞凋亡率的影响。
1 实验材料
1.1 细胞、药物和试剂
高分化PC12细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。Glu为Amresco产品；高糖DMEM粉剂培养基、胎牛血清、马血清、0.25%胰酶均为GIBCO产品；噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品；磷酸缓冲液(PBS)、二甲基亚砜(DMSO)为北京鼎国产品；Annexin v-FITC试剂盒购自晶美生物工程有限公司；Fluo-3/AM为Biotium Inc产品；LDH试剂盒购自南京建成生物工程研究所；细胞培养板为CORNING产品。β-细辛醚的制备由本中心完成，纯度99.44%。临用前称取适量β-细辛醚与吐温-80及甘油，以1∶1∶1充分混匀后加灭菌双蒸水配成终浓度为10 mg/mLβ-细辛醚溶液，用时培养基稀释至所需终浓度。
1.2 主要仪器设备
CO2培养箱(NUAIK)；倒置相差显微镜(OLYMPUS)； BIO-RAD550型酶标仪；ALTRA EPICS流式细胞仪(BECKMAN COULTER)；6010紫外可见分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司)。
2 实验方法
2.1 造模
复苏后的PC12细胞接种于25 cm2培养瓶中，培养液为含5%马血清、5%胎牛血清的DMEM高糖培养基，37 ℃、5% C02培养箱中培养。待细胞长满单层，0.25%胰酶消化，用含血清的DMEM培养基终止消化并调细胞密度为5×104 个/mL，接种在96孔培养板(弃去四周边孔)，每孔100 μL，四周边孔每孔加入等体积PBS溶液，待细胞贴壁生长交叉成网后用于实验。实验分为正常对照组、Glu(0.3～76.8 mmol/L)损伤组，继续培养16 h后观察细胞形态改变，并用MTT法检测细胞活力。
2.2 药物保护实验
PC12细胞接种于96孔(每孔100 μL)及24孔培养板(每孔1 mL)，培养条件同上，待细胞铺满单层，吸弃原培养基，用PBS液洗1次，随机分为6组。正常对照组和Glu损伤组加入无血清培养基，阳性对照组加入终浓度为10 μmol/L尼莫地平，β-细辛醚设3个剂量组，分别为7.5、15、30 μg/mL，培养4 h后，除正常对照组外，其余各组荡洗后加入终浓度为10 mmol/L的Glu继续培养16 h，用于各指标检测。
2.3 观察指标
细胞形态学观察、存活力(MTT法)、培养上清液LDH活性(比色法)、凋亡率和胞内钙离子浓度(流式细胞仪荧光染色法)。
2.4 统计学方法
数据以x±s表示，采用SPSS 11.0软件包分析，组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 谷氨酸对PC12细胞的损伤作用
PC12细胞培养2 h后完全贴壁，呈神经细胞样形态，圆形，折光性较强，生长速度快，2 d后生长成网状。PC12细胞经不同浓度Glu作用16 h后，0.3～4.8 mmol/L Glu对PC12细胞形态学和细胞活力没有明显变化，而9.6～76.8 mmol/L Glu则对PC12细胞有不同程度的损伤，表现为细胞变圆、皱缩，部分贴壁不良、脱落，裂解成碎片，折光度下降，细胞活力也明显下降，且呈剂量依赖关系，故本实验选用10 mmol/L Glu为造模浓度(见表1)。尼莫地平及β-细辛醚预孵育4 h，其细胞形态无明显变化。表1 不同浓度Glu对PC12细胞活力的影响(略)注：与正常对照组比较，*P≤0.001。
3.2 β-细辛醚对造模PC12细胞活力、谷氨酸的影响
(见表2)表2 β-细辛醚对造模PC12细胞活力和LDH的影响（略）注：与正常对照组比较，*P≤0.01，**P≤0.001；与Glu组比较，
△P≤0.01，△△P≤0.001(下同)。
3.3 β-细辛醚对造模PC12细胞凋亡率、胞浆游离钙的影响
(见表3)表3 β-细辛醚对造模PC12细胞凋亡和细胞内钙离子浓度的影响(略)
4 讨论
PC12 细胞株来源于大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，生长迅速、稳定，不易发生自动转化，可建立能传代的二倍体细胞系[1]。其细胞形态、结构和功能皆类似于神经细胞，成为近年来研究神经细胞递质合成、储存和释放、离子通道规律及受体的细胞模型[2]。
Glu是一种中枢兴奋性氨基酸递质，过量的Glu可促使突触前过量的蛋白激酶C(PKC)向细胞膜转移并活化，从而过度激活突触后膜的Glu受体——NMDA受体，促使Ca2+内流。细胞内Ca2+浓度上升又可激活细胞内的硫蛋白酶(calpin-I)，引起细胞内骨架蛋白-fordrin降解，使膜上Glu结合位点数量明显增加，导致胞内Ca2+超载，出现迟发性损害[3]。本实验用Glu造成PC12细胞损伤，通过观察和检测细胞形态学、细胞存活力、LDH释放量以及细胞凋亡和细胞内钙离子浓度的变化，探讨β-细辛醚对PC12细胞Glu损伤的保护作用及其作用机理。
本研究结果表明，PC12细胞受到Glu损伤后，细胞存活率降低、LDH漏出率升高、细胞凋亡率和死亡率升高、细胞内钙离子浓度升高；β-细辛醚能提高细胞存活率、降低LDH漏出率、抑制细胞凋亡和死亡、降低细胞内钙离子浓度。β-细辛醚与PC12细胞预温育4 h，可选择性降低Glu引起的细胞内游离Ca2+浓度的异常升高，抑制细胞凋亡，这可能是β-细辛醚能特异性且剂量依赖性地抑制Glu与其受体相结合，从而抑制受体门控钙通道的开放，减少胞外游离钙进入细胞内，减轻Glu的兴奋性毒性有关，从分子水平上初步阐明了β-细辛醚对兴奋性神经毒的保护作用机制。兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤作用总是伴随着钙超载现象，笔者认为，β-细辛醚对Glu引起的PC12细胞损伤的保护作用可能与其钙拮抗作用有关。
参考文献
[1] 张均田，张庆柱.神经药理学研究技术与方法[M]. 第2版.北京：人民卫生出版社，2005.9.
[2] Shafter TJ， Atchison WD. Transmitter， ion channel and receptor properties of PC12 cells：a model for neurotoxicological studies[J].Neurotoxicology，1991，12(3)：473－492.
[3] Papadopoulos MC， Koumenis IL， Giffard RG. Vulnerability to Glucose deprivation injury correlates with Glutathione levels in astrocytes[J].Brain Res，1997，748：151－156.