斑蝥酸钠诱导人食管癌Eca109细胞凋亡实验分析

【摘要】 目的 观察斑蝥酸钠体外对人食管癌Eca109细胞凋亡的影响。方法 应用MTT法，流式细胞仪检测，分析斑蝥酸钠对人食管癌Eca109细胞的生长和凋亡的影响。结果 斑蝥酸钠作用24 h可使人食管癌Eca109细胞生长明显抑制(P&<0.01)，并出现典型的凋亡峰。结论 斑蝥酸钠对人食管癌Eca109细胞生长有抑制作用，可诱导食管癌细胞凋亡。

【关键词】 斑蝥酸钠；食管癌；生长抑制；细胞凋亡；实验研究

　　Abstract：Objective To study sodium cantharidinate induced apoptosis of human esophageal carcinoma Eca109 in vitro. Methods The change of human esophageal carcinoma Eca109 treated with sodium cantharidinate were analyzed by MTT and FCM assay. Results Human esophageal carcinoma Eca109 were treated with sodium cantharidinate for 24 h， the cell proliferation was obviously inhibited (P&<0.01) and the cells showed a typical apoptotic peak. Conclusions Sodium cantharidinate can inhibit cell proliferation and induce cell apoptosis of esophageal carcinoma cells Eca109.
　　
　　Key words：Sodium cantharidinate；esophageal carcinoma；growth inhibition；apoptosis；Experimental Study

　　斑蝥酸钠(Sodium cantharidinate，SCA)是斑蝥素与氢氧化钠共热时水解生成[1]。临床单独使用或联合化疗对肝癌、胃癌、大肠癌等恶性肿瘤均有一定疗效，而且它还能配合放疗、化疗，提高治疗中晚期癌症的疗效，改善胸部不适、食欲减退、恶心呕吐等不同程度的放疗、化疗反应[2]，具有较显著的抗癌抑癌和免疫调节的双重作用，是一种广谱抗癌新药。但目前对其抗癌机理研究的报道则甚少。笔者以人食管癌Eca109细胞系为对象，采用MTT、流式细胞仪检测食管癌细胞的生长和凋亡的变化，观察斑蝥酸钠对人食管癌Eca109细胞系生长和凋亡的影响，探讨其抗食管癌的作用机理，为临床应用提供理论依据。

　　1 实验材料

　　1.1 试药

　　RPMI1640培养液，美国GIBCO；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；胰酶，南京生兴生物技术有限公司；MTT，上海伯奥生物科技公司；二甲基亚砜(DMSO，分析纯)，上海凌锋化学试剂有限公司，批号030820；顺铂(冻干型)，齐鲁制药有限公司，批号04050111；斑蝥酸钠注射液，贵州神奇集团，批号20041113。

　　1.2 细胞系

　　人食管癌细胞系Eca109，购于上海细胞所。将细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，长满后用0.25%
胰酶消化传代。

　　1.3 仪器

　　CO2培养箱，NAPCO，USA；DG-3022A酶标仪，国营华东电子管厂；FACSCaliuber型流式细胞仪，美国BD公司。

　　2 实验方法

　　2.1 药液的制备及分组

　　将班蝥酸钠注射液用适量的无血清RPMI1640培养液分别配成3种浓度，终浓度大、中、小剂量分别为5、2.5、1 μg/mL；顺铂作为阳性对照其剂量按临床用量换算，终浓度为25 μg/mL。实验共设用药组大、中、小3个浓度、阳性对照组和细胞对照组。

　　2.2 MTT检测法
　　
　　取处于指数生长期的人食管癌细胞Eca109，加入适量0.25%胰酶消化，用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液配成悬液，用血球细胞板计数，并以RPMI1640全成分培养液稀释细胞悬液，配成2×105/mL，取96孔平板，每孔加细胞悬液180 μL。再将每组药液20 μL分别加入各孔细胞悬液中，每个剂量重复4孔。将平板在37 ℃、含5% CO2的培养箱中孵育24 h后取出细胞培养板，MTT用无血清RPMI1640培养液配成1 mg/mL的溶液，每孔加100 μL，37 ℃温育4 h，使MTT还原为formazan，吸出上清液，加入100 μL DMSO使formazan溶解，混悬仪混匀后用酶标仪在490 nm处测定每孔光密度(A值)。
　　
　　结果分析：抑制率(%)=(1－加药组A值/对照组A值)×100%；存活率(%)=(加药组A值/对照组A值)×100%。

　　2.3 流式细胞仪检测

　　取处于指数生长期的人食管癌细胞Eca109，加药培养24 h后，用适量0.02% EDTA进行消化，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心，PBS洗涤2次，配成1×106/mL细胞悬液，75%冷乙醇-20 ℃固定，上机测定前，离心去乙醇，用PBS洗涤2次，用0.5 mL PBS悬浮细胞制成细胞悬液，加入PI染液0.5 mL，4 ℃避光染色30 min以上，经300目尼龙网过滤后，上流式细胞仪检测凋亡细胞的含量，并观察分析细胞周期。每个样本获取10 000个细胞，用ModFitLT3.0分析软件分析结果。结果判断：测定的DNA含量以直方图显示，直方图数据经计算机处理，确定细胞时相的百分比。位于G0～G1前期的亚二倍体峰为“凋亡峰”，其所占的比率为凋亡率。

　　2.4 统计学方法
　　
　　本实验A值以x±s表示，采用t检验分析，细胞生存率、抑制率和细胞凋亡率采用χ2检验。所有统计均用SPSS11.0统计软件包进行。

　　3 结果

　　(见表1～表3、图1) 表1 斑蝥酸钠对人食管癌细胞Eca109生长的影响（略）注：与细胞对照组比较，*P&<0.01(下同)。 表2 斑蝥酸钠对人食管癌Eca109细胞凋亡的作用（略） 表3 斑蝥酸钠对人食管癌细胞Eca109细胞周期的影响（略）

　　4 讨论

　　现代医学研究表明，肿瘤是细胞增殖、分化和细胞凋亡异常引起的以细胞失控性生长和增殖为主要特征的疾病。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，自己结束其生命的过程，具有严格的基因时控性和选择性[3]。食管癌的发生、发展同其他肿瘤性疾病一样，不仅与细胞的异常增殖和分化有关，也与细胞凋亡的异常有关。细胞周期阻断与细胞凋亡是肿瘤化疗的理论基础，阻断细胞周期与诱导细胞凋亡密切相关。

　　斑蝥虫体所含的斑蝥素(cantharidin， CTD)为抗癌有效物质，但毒性很强。随着人们对其药用机理研究的深入，相继合成了多种斑蝥素衍生物。这些衍生物较斑蝥素毒性明显降低，药理作用更加明确，而且均有与斑蝥素类似的抗肿瘤作用[3]。斑蝥酸钠就是其中一种，与其它衍生物相比，它的抗癌谱比较广，对多种恶性肿瘤均有较好疗效。我们将斑蝥酸钠在体外作用于人食管癌细胞系Eca109，采用MTT、流式细胞仪检测食管癌细胞的生长和凋亡的变化。实验中发现，斑蝥酸钠作用24 h致食管癌细胞出现明显生长抑制现象，大剂量组可见凋亡峰，凋亡率明显增加，与细胞对照组相比差异有显著性意义。提示大剂量斑蝥酸钠在体外可抑制食管癌细胞生长，诱导食管癌细胞的凋亡。

参考文献