【关键词】 高效改良羊水细胞培养 产前诊断 临床应用
羊水细胞培养是产前诊断的一个重要技术手段，主要应用于胎儿染色体疾病的产前诊断。由于羊水中存活细胞比较少、培养周期长、无菌要求和技术要求高，容易失败，使羊水细胞培养在产前诊断的应用受到限制。针对以上情况，近年来我们吸取了国内外的一些先进经验[1，2]，结合自身的条件，与相关科室进行合作，对羊水细胞培养技术进行改进，并对1 200例孕15～30周孕妇进行了羊水细胞培养的产前诊断，取得了理想效果。
对象与方法
1.对象：选取2003年7月至2005年12月在河南省新乡市妇幼保健院接受产前羊水细胞培养检查的孕妇共计1 200例，常规羊水细胞培养(常规组)和高效改良羊水细胞培养(改良组)均抽取600例。来诊孕妇按1∶1的比例随机分成2组。常规组年龄分布(28.8±3.6)岁，孕周分布孕15～24周，平均(20.2±2.8)周，改良组年龄分布(28.5±3.7)岁，孕周分布15～24周，平均(20.3±2.7)周，2组年龄、孕周比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。本次高效改良羊水细胞培养科研项目经过新乡市妇幼保健院医学伦理委员会批准施行。
2.检验方法：对羊水细胞培养后在显微镜下进行观察，检查染色体情况，进行染色体异型性分析。根据分析结果统计检验量。(1)常规羊水细胞培养。取妊娠16～20周的羊水10～20 ml，注入10 ml离心管中，1 000 r/min心10 min，弃去上清液，留0.5～1.0 ml轻轻吹打成细胞悬液，移入25 ml培养瓶中，加入pH值为6.8的F10培养液3 ml和血清1 ml，置37 ℃温箱中静置培养5～6 d，见纤维或上皮样细胞生长，以后每天或隔天观察一次，一般培养8～14 d，细胞进入旺盛生长期[3]。(2)高效改良羊水细胞培养。穿刺抽取羊水25 ml，然后分别取10 ml注入2只20 ml试管中，高速离心(1 000 r/min)8 min，上清液弃去，每只试管中留4～5 ml制备成细胞混悬液。在培养皿中培养液4 ml，缓慢滴入细胞混悬液，恒温(37.5 ℃)静置。根据文献报道，一般6～9 d细胞生长最为旺盛，可以收获细胞。收获前30 min，滴定秋水仙素终末浓度2 mg/L。收获先后进行离心，低渗，固定和制片程序。标本经过老化后用胰酶染色并消化，然后在显微镜下观察。我们于10倍目镜和10倍物镜下观察。以梭长形羊水细胞为主要类型的生长细胞，形成的细胞克隆覆盖1个或1个以上的完整视野;培养瓶中有2～3个以上细胞克隆，且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、双圆形或葡萄状透亮细胞，细胞核大而圆，细胞圆而大，明亮如一片明珠，相互联接，细胞克隆中央的细胞开始老化，克隆周边细胞生长旺盛。
3.统计学处理：统计培养时间，镜下观察后，进行统计记录，然后进行计数资料的χ2检验。
结果
1.2组培养时间比较：常规组的总体培养时间为9～14 d，平均(11.0±2.6) d;改良组的总体培养时间6～10 d，平均(7.5±2.3) d。改良组培养时间和常规组相比较明显缩短，差异有统计学意义(P&<0.05)，2组均未发生宫内感染或者胎儿死亡。
2.成功率比较：改良组羊水细胞培养的成功率为95.8 %(575/600)，常规组成功率为37.7 %(226/600)，改良组羊水细胞培养的成功率明显高于常规组，差异有统计学意义(χ2 =4.25，P&<0.01)。
3.分裂相检出率比较：改良组分裂相平均每例为(93.6±22.1)个，常规组分裂相为(53.2±19.9)个，改良组分裂相的检出率明显高于常规组，差异有统计学意义(χ2=4.95，P&<0.01)。
4.异常检出率比较：改良组发现异常核型12例，其中21-三体综合征6例(50.0 %)，18-三体综合征3例(25.0 %)，其他3例(25.0 %)，总阳性率为2.0 %(12/6 000)。常规组发现异常核型4例，其中21-三体综合征2例(50.0 %)，18-三体综合征2例(25.0 %)，其他2例(25.0 %)，总阳性率为0.7 %(4/6 000)。改良组异常核型检出率高于常规组，但是2组检出的异常核型的比例基本相同，都分别是21-三体综合征50.0 %，18-三体综合征25.0 %，其他25.0 %，差异有统计学意义 (χ2 =4.12，P&<0.01)。
讨论
羊水细胞培养法是1966年首先应用于临床胎儿染色体疾病的产前诊断并获得成功的[4]，此后广泛应用并成为目前产前诊断的重要技术手段[5];然而其无菌要求、恒温要求、培养接种和收获技巧比较高，容易失败。在此基础上，我们结合临床实际，对该方法进行了改良：(1)增加抽取羊水量;(2)2只试管离心;(3)细胞悬液量增加;(4)收获前30 min，滴定秋水仙素终末浓度2 mg/L。收获先后进行离心，低渗，固定和制片程序。标本经过老化后用胰酶染色并消化。经改良后提高了效率，并且在临床应用中取得了良好的效果。
普通羊水细胞培养法和高效改良羊水细胞培养法都是比较安全可靠的产前诊断方法。高效改良羊水细胞培养法的培养时间可以缩短3～4 d，培养成功率远远高于普通羊水细胞培养法，而且分裂相，异常核型的发现比率等技术指标都高于普通羊水细胞培养法，具有较高的临床应用价值，值得在临床推广应用。
参考文献
1Lam Y H， Tang M H， Sin S Y， et al.Clinical significance of amniotic-fluid-cell culture failure[J]. Prenat Diagn，1998.18(4)：343-347.
2马长俊，陈园茶，霍沛丹.羊水培养与染色体制片方法[J].生殖与避孕，1985，5:23.
3程在玉，主编.医学遗传学基础与临床[M].青岛：青岛出版社，1993.75.
4于松，金镇.胎儿染色体疾病及单基因疾病侵入性产前诊断[J].中国实用妇科与产科杂志，2008，24(2):94.
5Steele M W ， Breg W R Jr. Chromosome analysis of human ammiotic-fluid cell[J]s.Lancet，1966，1(7434):383-385.