组蛋白去乙酰化酶抑制剂对前列腺癌PC3细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

【摘要】 目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对前列腺癌PC3细胞株的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法 前列腺癌PC3细胞经不同剂量组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用后， MTT法测定组蛋白去乙酰化酶抑制剂对PC3细胞的增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡峰，荧光分光光度计测定caspase3的活性。结果 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对PC3细胞有显著的增殖抑制作用，呈时间剂量依赖性;细胞周期被阻滞于G1 /G0期，S期细胞减少;组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用后加药组caspase3表达增加，与对照组比较有显著差异(P<0.01)。结论 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对PC3细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用。

【关键词】 组蛋白去乙酰化酶抑制剂;前列腺癌细胞株PC3;细胞凋亡

组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制之一，与癌症的发生密切相关。近年研究表明，染色体组蛋白乙酰化水平的变化与细胞周期进程的变化密切相关〔1〕。人们发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)可以使细胞周期停滞在G1和G2期〔2〕。曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)是一种氧肟酸类HDAC抑制剂，为一种抗真菌类药物，能抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性，这一类HDAC抑制剂被证明可在小剂量、低浓度情况下导致肿瘤分化，并选择性地抑制肿瘤生长而对正常细胞无毒副作用〔3〕。本研究通过选用不同浓度的TSA作用于前列腺癌PC3细胞株，旨在探讨TSA对人前列腺癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，并初步分析其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 TSA 购自美国Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)稀释成工作液，等量分装，置于-20℃保存，用前解冻。胎牛血清、RPMI1640、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、DMSO、胰蛋白酶均购于为北京华美公司;碘化丙啶(PI)、caspase3检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。

　　1.2 细胞系及细胞培养 前列腺癌PC3细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所，置于37℃、饱和湿度的5% CO2培养箱中开放培养，培养用RPMI1640培养液(含10%小牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/L)。细胞呈单层贴壁生长，达80%左右融合时用0.25% 的胰蛋白酶消化传代，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

　　1.3 细胞增殖抑制实验(MTT法) 取对数生长期的PC3细胞按1×104/L接种于96孔细胞培养板中，每孔200 μl，实验组分别加人不同浓度的TSA 20 μl (终浓度分别为10、50、250、1 250 nmol/L)，对照组加入与TSA等量的培养液20 μl，每组设3个平行孔。置于37℃、5% CO2培养箱内培养，分别于第1、2天进行处理，每孔加人20 μl MTT液(5 g/L，以PBS缓冲液配制)，继续培养4 h后，弃上清，每孔再加入DMSO 150 μl，震荡10 min，用酶标仪于492 nm波长下测定每孔的吸光度(A)值。计算公式：抑制率(%)=(1-A对照/A实验)×100%。

　　1.4 流式细胞仪检测凋亡及细胞周期分析 取对数生长期的PC3细胞按1×106/L接种于6孔细胞培养板中，实验组加入终浓度为750 nmol/L的TSA，对照组加入与TSA等量的培养液，作用24 h后，无菌收集细胞〔数目约(1～5)×106个/ml〕1 200 r/min离心5 min，弃去培养液，加人PBS洗涤细胞2次，然后用预冷的无水乙醇(乙醇终浓度为70%)固定，4℃ 过夜后再用PBS洗2次以去掉固定液，加入PI综合染液1 ml(50 μg/ml PI，20 μg/ml RNase，0.1%Triton X100)，至4℃避光30 min后上机检测，每组重复3次。

　　1.5 Caspase3活性检测 取对数生长期的PC3细胞，实验组加入终浓度为750 nmol/L的TSA，对照组加人与TSA等量的培养液，作用24 h后，胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600 r/min 4℃离心5 min收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤1次。同前吸尽上清后，按照每2×106细胞加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min，立即测定caspase3的酶活性。

　　1.6 统计学处理 使用SPSS10.0统狡软件。计数资料和率的比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度TSA对PC3细胞的抑制作用 10、50、250、1 250 nmol/L TSA处理PC3细胞24 h后，随浓度增加，吸光度逐渐降低，当浓度>250 nmol/L时，与对照组比较有显著差异(P<0.001)(见表1)。细胞存活率分别为80%、75%、62%、49%，与上述结果一致。表1 曲古抑菌素对PC3细胞的抑制作用与对照组比较：1)P<0.001

　　2.2 流式细胞术检测细胞凋亡情况 在细胞DNA直方图上，G1峰前出现亚二倍体峰。对照组细胞凋亡率5.34%;实验组凋亡率15.19%，组间比较有显著性差异(P<0.01)。

　　2.3 TSA通过激活caspase3诱导细胞凋亡 与对照组相比较，实验组 caspase3水平明显增加，并呈时间依赖性。见表2。表2 caspase3检测结果与对照组比较：1)P<0.001

　　3 讨 论

　　乙酰化是一种可逆的蛋白质共价修饰形式，由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和HDAC共同调控。组蛋白的低乙酰化和高甲基化是肿瘤细胞的主要特征之一，因此肿瘤细胞内过度表达的HDAC成为化疗药物研制和作用的靶蛋白。HDACi是一类从生物体内提取或化学合成的化合物，能够特异性结合HDAC并抑制其酶活性，促进组蛋白与非组蛋白的乙酰化修饰， 从而活化多种信号转导途径，抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡〔4〕。近年来，HDACi的抗肿瘤作用得到越来越多的关注，研究表明TSA作为HDACi的代表药可诱导多种肿瘤细胞株的生长阻滞、分化及凋亡〔5，6〕，但抗肿瘤的具体机制尚不清楚。本研究通过TSA抑制细胞生长实验显示，随着TSA药物浓度和作用时间的延长，PC3细胞的生长逐步受到抑制，TSA对PC3细胞的生长抑制效应同样呈时间、浓度依赖性，这些结果表明TSA可明显抑制PC3细胞的生长。在细胞DNA直方图上，G1峰前出现亚二倍体峰，即凋亡细胞形成凋亡峰(AP峰)，结合形态学的凋亡改变表明TSA在体外有诱导PC3细胞株凋亡的作用。

　　在凋亡过程中caspas3是caspase酶联反应的终末因子。caspase的功能在于溶解细胞和启动细胞对凋亡信号的反应〔7〕。激活的caspase3裂解细胞的关键结构蛋白和看家蛋白，其上游因子可能是线粒体。目前认为线粒体在调节细胞凋亡中也具有重要的作用〔8〕，机制是通过改变细胞线粒体的还原氧化电位、释放激活caspase的蛋白如线粒体呼吸链蛋白细胞色素C从线粒体释放到胞浆，激活caspase3或通过其上游的caspase 8、9起作用。caspase3目前在caspase家族中被认为是多种诱导剂刺激后导致凋亡的关键酶。本实验中casepase3可以催化底物AcDEVDpNA产生黄色的pNA，从而可以通过测定吸光度来检测caspase3的活性。pNA在405 nm附近有强吸收。结果显示caspase3蛋白表达增加，而且呈时间依赖性，由此可见，caspase3参与TSA诱导的PC3细胞凋亡。

　　以上结果表明TSA具有直接抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导凋亡作用。这种效应可能与细胞周期停滞在G1期及激活caspase3诱导的凋亡途径有关。TSA促凋亡的其他信号传导途径尚待进一步研究。

参考文献

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　　7 蔡 真， 林茂芳.高三尖杉酯碱通过激活Caspase3诱导T〔J〕.肿瘤免疫学，2000;16(11)：60710.

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