丹参酮ⅡA对谷氨酸联合淀粉样蛋白诱导细胞损伤的保护作用

　　　　 作者：张萌涛 钱亦华 杨杰 史利利 朱淑娟 刘朝晖

【摘要】 目的 探讨丹参酮ⅡA(TanⅡA)对谷氨酸(Glu)联合β淀粉样蛋白2535 (Aβ2535)诱导PC12细胞、Meynert核(nbM)神经元损伤的保护作用。方法 培养PC12细胞，用MTT法观察TanⅡA三个不同浓度(2.5、5.0、10 μmol/L)对Glu联合Aβ2535损伤PC12细胞的保护作用;运用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术，检测急性分离nbM神经元在Glu联合Aβ诱导损伤时细胞内钙离子浓度(〔Ca2+〕i)变化，及不同浓度TanⅡA对这种〔Ca2+〕i变化的影响。结果 MTT检测结果表明，TanⅡA 各组细胞活力、损伤程度与单纯Aβ+Glu损伤组相比有显著差异(P<0.05)，但无剂量依赖关系。Glu联合Aβ2535损伤组〔Ca2+〕i比对照组显著升高(P<0.01);TanⅡA 各组〔Ca2+〕i均较单独Glu联合Aβ2535处理组有显著降低(P<0.01)。结论 TanⅡA通过提高细胞活力、维持细胞内钙离子浓度稳态以对抗Glu联合Aβ2535损伤作用。

【关键词】 阿尔茨海默病;β淀粉样蛋白;谷氨酸;Meynert基底核;PC12细胞

　　【Abstract】 Objective To explore the protection of TanshinoneⅡA (TanⅡA) on damage of PC12 cells and nucleus basalis of meynert (nbM) neurons induced by glutamate (Glu) and βamyloid protein 25～35 (Aβ25～35). Methods MTT assay was used to observe the protection of different dosages of Tan ⅡA(2.5， 5.0， 10 μmol/L)on cellular damage induced by Glu and Aβ2535. Laser scanning confocal microscopy (LSCM) technique was adopted to detect the change of the intracellular free calcium concentration (〔Ca2+〕i). Results There were significant differences on the cell survival and the extent of damage between the each Tan ⅡA group and Aβ+Glu group (P<0.05)， but there wasn′t dosedependent manner. The level of 〔Ca2+〕i in Glu+Aβ25～35 group was significantly higher than that of control group (P<0.01). The level of 〔Ca2+〕i in each Tan ⅡA goup was significantly lower than that of Glu+Aβ2535 group(P<0.01). Conclusions Tan ⅡA can be against the cellular damage induced by Glu and Aβ2535 through increasing cell survival and sustaining the homeostasis of 〔Ca2+〕i.

　　【Key words】 Alzheimer′s disease (AD); βamyloid protein (Aβ); Glutamate (Glu); Nucleus basalis of Meynert (nbM); PC12 cells

　　 目前西医治疗阿尔茨海默病(AD)主要是停留在缓解症状上。相比之下，祖国医学在延缓衰老以及老年性疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，具有潜在的优势和广阔的开发前景。中药丹参〔1〕属于活血化瘀类中药，同时具有养血安神功效。丹参酮ⅡA(TanⅡA)为丹参有效成分之一，为脂溶性、樱红色、针状结晶。TanⅡA分子式C19H18O3，分子量294.33，含有醌型结构，易被氧化还原，可参与机体的多种生化反应而有多种生物活性，如降低血液黏滞度、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、清除氧自由基、抗脂质氧化、抗肿瘤、抗菌、消炎、雌激素样作用、保护神经元细胞及改善心脑缺血等广泛的药理作用。在心肌缺血/灌注损伤防治中，TanⅡA具有类异搏停样L型钙通道阻断剂作用〔2〕。本研究将探索TanⅡA对谷氨酸(Glu)联合β淀粉样蛋白2535(Aβ2535)诱导PC12细胞、Meynert核(nbM)神经元损伤的保护作用，以便为寻找有效防治AD中药提供实验数据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 TanⅡA (西安鸿生生物技术有限公司);噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);DMEM培养基(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程公司);Glu、Aβ2535、Fluo3/AM、HEPES、钙离子载体Ionomycin均购于美国Sigma公司;EGTA(Amresco)。PC12细胞为张葳蕤惠赠。实验动物：正常SD大鼠(10～15 d)，体重约20～30 g，雌雄不拘，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PC12细胞的培养及大鼠nbM神经元的急性分离 PC12细胞用含有15%新生牛血清的DMEM培养基培养，置37℃、5% CO2培养箱内，隔2 d换液一次，当细胞生长达70%～80%融合时传代、继续培养。取对数生长期的细胞用于实验。急性分离nbM神经元的方法参照文献〔3，4〕：根据包新民等〔5〕所编的大鼠脑立体定位图谱来定位nbM。大鼠在10%水合氯醛腹腔麻醉下，快速断头取脑，移入冰的标准细胞外液(通O2)中冰浴约1 min，快速修剪后黏到标本台上放入切片机槽内切活脑片，片厚400 μm，将切片移入标准细胞外液中(通O2)，孵育平衡50 min;31℃条件下，用 0.016% pronase E消化20～30 min;再移入标准细胞外液中平衡1.5～2 h，用特制的针扎取nbM，放入充氧的标准细胞外液中，使用不同内径并经过热抛光的Pasteur玻璃管吹散组织块，使之成为单细胞悬液。移细胞悬液至多聚赖氨酸预处理的Petri培养皿中，20 min后待神经元完全贴附于培养皿上，用标准细胞外液轻轻冲洗培养皿2～3次，洗掉未贴壁的细胞及组织碎片，继续下一步实验。整个实验过程在20℃～26℃条件下进行。

　　1.2.2 主要溶液及其配制 Aβ的“老化处理”：将Aβ2535溶解于消毒的三蒸水，37℃孵育72 h，使其变成聚集状的Aβ，储备浓度10 μmol/L，4℃保存，用时用DMEM培养液稀释成工作浓度;TanⅡA配制：用二甲基亚砜(DMSO)避光震荡溶解TanⅡA干粉，配成1 mmol/L储备浓度，4℃保存;用时再和培养液稀释成工作浓度;标准细胞外液(mmol/L)：NaCl 150，KCl 5，CaCl2 2，MgCl2 1，HEPES 10，葡萄糖10，将以上成分按浓度溶解于去离子水中，用Trisbase将pH值调至7.4;Fluo3/AM，用DMSO配成885 μmol/L，置20℃避光保存。

　　1.3 实验处理

　　1.3.1 PC12细胞的实验处理 取对数生长期的PC12细胞，使其密度约105个/ml，每孔100 μl，接种于96孔板。实验分3组：空白对照组、Glu组、Aβ+Glu损伤组，Aβ+Glu损伤组又分为单纯Aβ+Glu损伤组和TanⅡA组，其中TanⅡA组再分为2.5、5.0、10 μmol/L三个浓度亚组。用100 nmol/L的Aβ提前处理Aβ+Glu损伤组细胞12 h，再加入5 mmol/L Glu处理24 h，TanⅡA组将Glu和TanⅡA同时加入处理24 h，倒置显微镜下观察形态学变化，MTT法观察细胞活力。其中空白对照组加等量的培养液代替。

　　1.3.2 MTT法检测 取对数生长期的PC12细胞，使细胞密度约105个/ml，每孔100 μl，接种于96孔板。按照上述实验分组(每组8孔)和处理后进行MTT 检测：每孔加入噻唑蓝(5 mg/ml)20 μl，置于37℃、5% CO2培养箱孵育4 h，小心吸弃每孔的培养液后，每孔加入150 μl DMSO，置振荡器震荡至紫色结晶完全溶解，酶联免疫检测仪492 nm 波长，630校正参数，测定光密度(OD)值，以对照组存活率为100%作为基准，来研究分析其他各组变化。重复实验3次。

　　1.3.3 大鼠nbM 神经元〔Ca2+〕i测定 实验分为空白对照组和Aβ+Glu损伤组，Aβ+Glu损伤组又分为单纯Aβ+Glu损伤组、TanⅡA组，其中TanⅡA组再分为2.5、5.0、10 μmol/L三个浓度亚组。nbM神经元Fluo3/AM负载：急性分离的nbM神经元接种于Petri培养皿。Petri培养皿加入终浓度为8.85 μmol/L的Fluo3/AM 100 μl，37℃避光孵育40 min负载。上机检测细胞负载情况，用标准细胞外液洗去负载液。〔Ca2+〕i动态变化的LSCM检测：将装有负载好的nbM 神经元的Petri培养皿置入载样台，在TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)下动态扫描细胞荧光强度变化，激发波长488 nm，发射波长526 nm。首先在荧光屏的直视下找出Fluo3负载良好的细胞，观察其荧光图像，于静息状态下快速预扫描2～3 min，获得基线值，然后用微量进样器加入干预因素即时进行检测，并绘出细胞〔Ca2+〕i变化的荧光光密度曲线图。每40 s扫描一次，共扫描40 min。〔Ca2+〕i计算公式为：〔Ca2+〕i=Kd×〔(F-Fmin) /(Fmax-F)〕。Kd是Fluo3与Ca2+反应的解离常数，Kd=400 nmol/L;F为所测到的荧光光密度值;Fmax为加入8 μmol/L的Ionomycin使Ca2+饱和后所测得的最大值;Fmin为加入10 mmol/L EGTA测得的最小值。

　　1.4 统计学处理 所有数据均以x±s表示，组间的显著性采用单因素方差分析，数据处理过程由SPSS13.0软件完成。

　　2 结 果

　　2.1 各组PC12细胞形态学变化 倒置显微镜下形态学观察结果(图1)可见对照组细胞表面光滑、光晕明显、突起长，胞体呈梭形、锥形和椭圆形等;Glu损伤组胞浆内有细小黒色颗粒，细胞形状和对照组比较无明显差异，但细胞周围光晕减弱、细胞密度降低;经100 nmol/L Aβ2535预处理的细胞与对照组比较变化不明显，当再加入5 mmol/L Glu继续孵育24 h后，部分细胞突起回缩，胞体肿胀，胞浆内出现大量黑色颗粒物质，细胞密度显著降低，个别细胞完全崩解;用不同浓度TanⅡA处理后，细胞形态接近对照组，没有明显变化。细胞密度比Glu损伤组明显提高。

　　2.2 TanⅡA对Glu联合Aβ2535诱导PC12损伤的影响 Aβ+Glu组细胞存活力比对照组降低了12.3%，有显著性差异(P<0.05);经TanⅡA处理各组分别较Aβ+Glu组细胞存活力增加了4.7%、5.4%、4.7%，差异显著(P<0.05);各TanⅡA组间无显著差异(表1)。

　　2.3 TanⅡA对大鼠nbM 神经元〔Ca2+〕i的影响 见表1，与空白对照组比较，Aβ+Glu组〔Ca2+〕i水平显著升高(P<0.01);与Aβ+Glu组比较，TanⅡA各组〔Ca2+〕i水平显著降低(P<0.01)。表1 TanⅡA对Glu联合Aβ2535诱导PC12、nbM损伤的影响与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与Aβ+Glu组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

　　A～F：分别为空白对照组;Glu组;Aβ+Glu组;Aβ+Glu+TanⅡA 2.5、5、10 μmol/L组

　　图1 各组PC12细胞形态学变化(×250)

　　3 讨 论

　　制备可靠的AD模型将有助于研究、寻找AD的有效防治措施，因此建立AD动物模型和细胞模型的研究一直是国内外学者探索的热点。以往用PC12细胞模拟AD细胞模型〔6〕的报告不少，本研究应用的细胞模型是借鉴本课题组前期研究采用原代培养基底前脑神经元模拟AD细胞模型方法〔7，8〕，其特长在于：将亚毒性剂量(100 nmol/L)的Aβ2535与Glu(5 mmol/L)联合作用于PC12细胞和急性分离nbM神经元，在细胞水平以模拟出AD病变发生发展过程中的一个重要的侧面，即与AD病相关的β淀粉样蛋白的神经毒性，谷氨酸的兴奋性毒性的机制，为筛选开发防治AD新药奠定了基础，提供了实验依据。

　　Aβ是一个含有39～42个氨基酸的肽，为β淀粉样蛋白前体蛋白(βAPP)水解产物。Aβ在脑内沉积是AD组织病理学特征性改变。Aβ引起神经毒性重要部位是第25～35位的氨基酸序列。Glu是哺乳动物脑内正常的且含量最高的兴奋性氨基酸，参与中枢神经系统的信号传递，对神经系统正常功能的维持及学习记忆功能起重要的作用。研究表明兴奋性氨基酸产生的兴奋性毒性与Aβ细胞毒性有协同作用〔7，9〕。早期的Glu持续兴奋作用最终可导致Glu能递质系统衰竭而引起Glu及其受体或受体后改变，这种变化有利于APP产生Aβ。突触间隙高浓度的Glu可间接的通过酸化环境增加Aβ的聚合，导致具有神经毒性的淀粉样蛋白纤维数量增加〔10〕。生理状态下，Glu对神经细胞的兴奋作用快速而短暂，导致神经细胞去极化，产生兴奋性突触后电位，直接参与脑的学习和记忆活动〔11〕;病理情况下，中枢神经系统内的兴奋性/抑制性氨基酸平衡被打破，组织内Glu浓度急剧升高，神经元上的NMDA受体门控的通道是Glu引起的Ca2+内流的主要途径，当其过度激活时可致细胞内钙超载，激活系列链式反应直接导致神经元的退行性病变和迟发性坏死。

　　1989年Disterhoft〔12〕提出了AD和脑老化的胞内钙(〔Ca2+〕i)平衡自体失衡假说，认为神经细胞内的生理钙浓度是维持其正常功能所必须的，但〔Ca2+〕i的持续升高会导致神经元损伤，为AD的退行性变提供了最后共同通路。本研究采用Glu联合Aβ2535诱导PC12细胞、nbM神经元损伤，一方面表现为PC12细胞活力降低;另一方面观察到了nbM神经元〔Ca2+〕i增加，提示Glu和Aβ2535联合作用可能激活了神经元上NMDA受体，引起Ca2+通道过度开放，Ca2+内流增加致细胞内钙超载。

　　中药丹参已在临床广泛应用，TanⅡA是丹参提取物有效活性成分之一，文献报道〔13～15〕其具有多种功效。本实验结果表明TanⅡA能提高PC12细胞活力，LSCM观察分析显示TanⅡA浓度在2.5～10 μmol/L之间均可以减轻Glu联合Aβ引起的nbM神经元内钙超载。但TanⅡA对PC12细胞和nbM神经元的神经保护作用在本实验采用的浓度范围内不存在剂量依赖关系。本研究提示，TanⅡA通过提高细胞存活力和维持细胞内钙离子浓度稳态以对抗Glu联合Aβ2535损伤作用。TanⅡA防治AD的详细作用及其机制有待于进一步深入研究。

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