云芝多糖、维生素E对小鼠CCl4肝损伤保护作用的研究

　　　　 作者：孙设宗 唐微 张红梅 赵杰

【摘要】 目的 观察云芝多糖(CVP)及CVP和VE联合应用对CCl4肝损伤的作用，探讨CVP抗肝损伤的作用机制。方法 4月龄昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组、造模组、CVP灌胃高低剂量保护组(300、150 mg)、CVP和VE保护组(VE 250 mg+150 mg CVP、VE 250 mg+300 mg CVP)，每组10只。用CVP灌胃饲料中加VE，饲养7 d，末次灌胃2 h，正常对照组腹腔注射调和油溶液，其余各组腹腔注射0.15%CCl4调和油溶液(10 ml/kg体重)，24 h眼球取血后处死小鼠，取出肝脏称重计算肝体指数后制备肝匀浆;测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量。结果 与模型组比较，CVP可降低肝体指数及血清中ALT和AST的含量(P<0.05，P<0.01);提高SOD活性和GSH的含量(P<0.01)，降低MDA的含量(P<0.001)，与VE联合应用有协同效应。结论 CVP可减轻实验性肝损伤所致炎性浸润，提高SOD的活性和GSH的含量，加速自由基的清除，对实验性肝损伤有保护作用，与VE联合应用有协同效应。

【关键词】 云芝多糖;维生素E;肝损伤;保护作用

云芝多糖(Coriolus versciclor polysaccharides CVP)具有多种生物活性，可提高抗氧化酶活性、清除自由基以及对氧化应激有抑制和拮抗作用〔1，2〕;维生素E(VE)是经典的抗氧化物质〔3〕。各种原因的肝损伤与氧化应激密切相关，但CVP对肝损伤保护作用及机制的研究报道较少，CVP、VE联合应用对实验性肝损伤保护作用尚未见报道。本文以CCl4制备肝损伤模型，研究CVP单独应用及CVP和VE联合应用抗实验性肝损伤的作用及机制，为拓展CVP和VE的临床应用提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物 昆明种4月龄雌性小鼠60只，体重32～38 g/只，本院动物中心提供。

　　1.2 药品、试剂与仪器 丙二醛(MDA)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)，超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其余为国产分析纯生化试剂。ZS831型内切式组织匀浆机(浙西机械厂)，MDF382E型超低温冰箱(日本Sony公司)，722S型分光光度计(上海第二光学仪器厂)，RA50半自动生化分析仪(美国Technicon公司)。

　　1.3 给药方法 60只小鼠随机分为正常对照组(常规饲料，饮自来水)、病理造模组(常规饲料，饮自来水)、CVP保护组(高、低二组，常规饲料，自由饮水，每天按体重300、150 mg/kg CVP灌胃1次)、CVP+VE保护组(每天按体重150、300 mg/kg CVP灌胃，同时给予饲料中加VE 250 mg/kg饲料，自由饮水)，每组10只。饲养7 d，末次灌胃2 h，正常对照组腹腔注射调和油溶液，其余各组腹腔注射0.15%CCl4调和油溶液(10 ml/kg体重)，24 h后眼球取血，分离血清，用速率法测ALT、AST。

　　1.4 检测指标 处死小鼠，取出肝脏置冰生理盐水中洗净血液，用滤纸吸去水分称重，计算肝体指数;用pH7.4的PBS按1∶10稀释冰浴下制备肝匀浆，4 000 r/min离心5 min，取上清液用双缩脲法测肝匀浆中蛋白质含量，用PBS稀释成4 mg/ml蛋白，按试剂盒要求测MDA、GSH、SOD的含量。取上述各组肝匀浆按文献〔4〕报道方法略作改进，进行体外抗氧化实验，用722S分光光度计检测波长为532 nm处的吸光度值，以A532 nm反映MDA的含量。计算CVP对MDA产生的抑制率。

　　1.5 统计学处理 用SPSS 10.0软件进行方差分析，数据用x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 CVP、VE对小鼠CCl4肝损伤模型鼠血清ALT和AST的影响 与对照组比较，模型组CCl4肝损伤小鼠血清ALT和AST活性显著升高(P<0.01)，说明制备小鼠损伤模型是成功的。CVP可降低血清ALT活性，与模型组比较无统计学意义;但是CVP可明显的降低小鼠血清中AST的活性(P<0.05);VE和CVP联合应用对膜损伤的保护作用加强，与模型组比较ALT、AST显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表1。表1 CVP、VE对小鼠CCl4肝损伤模型血清ALT和AST的影响与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

　　2.2 CVP、VE对小鼠CCl4肝损伤模型鼠肝体指数及肝匀浆MDA的影响 小鼠CCl4肝损伤模型组肝体指数增大，说明CCl4肝损伤可导致肝细胞肿胀及炎性浸润，CVP保护组可降低肝体指数，与模型组比较有统计学差异(P<0.05)，VE和CVP联合应用有协同作用，但存在量效关系(P<0.05，P<0.01)。CVP保护组及VE、CVP联合应用均可降低MDA的含量(P<0.001)，见表2。表2 CVP、VE对CCl4肝损伤模型肝体指数及肝匀浆MDA的作用与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001，下表同

　　2.3 CVP、VE对CCl4肝损伤模型鼠SOD活性及GSH含量的影响 CCl4肝损伤模型组SOD活性和GSH含量明显降低，不同浓度的CVP可增加SOD的活性和GSH的含量，与模型组比较有统计学意义(P<0.01)，VE和CVP联合应用与CVP单独应用比较，SOD活性和GSH的含量反而降低，但与模型组比较SOD活性和GSH的含量仍然明显升高(P<0.05)。见表3。表3 CVP、VE对CCl4肝损伤模型SOD活性及GSH含量的影响

　　2.4 CVP、VE对体外诱导脂质过氧化物产生的抑制作用 模型组A532 nm吸光度值与对照组比较明显升高，说明CCl4肝损伤消耗细胞内的还原当量，抗氧化能力较弱;CVP保护组可增加抗氧化能力，但与CVP浓度并不呈正比，以150 mg CVP保护组对脂质过氧化物产生的抑制作用最强，VE、CVP联合应用抗生素氧化能力增强。见表4。表4 CVP、VE对体外诱导脂质过氧化物产生的抑制率

　　3 讨 论

　　CCl4进是经典的肝损伤毒物，经肝细胞代谢产生自由基，无选择性的损伤肝细胞的各个组分，首先引起膜性损伤，严重时可导致肝细胞变性坏死〔5〕。本研究表明CCl4可致实验性肝损伤，通过脂质过氧化作用产生过量的自由基广泛损伤肝细胞，导致模型组小鼠肝体指数增加，MDA、ALT、AST显著升高，SOD、GSH降低。

　　ALT和AST是反映肝细胞损伤和线粒体膜损伤的重要指标。ALT存在细胞的可溶部分，正常情况下血清中ALT活性极低，当肝细胞损伤时膜通透性增大ALT释放入血而导致升高，CVP保护组可降低血清ALT活性，但与模型组比较无统计学意义，说明CVP直接清除自由基的能力较弱;VE和CVP联合应用对肝细膜的保护作用加强，与模型组比较可显著降低血清ALT的活性。AST主要分布在线粒体内〔6〕，血清中AST的含量可反映线粒体的受损情况，不同浓度CVP保护组可降低血清AST的含量，与模型组比较有显著差异，提示CVP对线粒体膜的保护作用较强;VE和CVP联合应用有协同效应，血清AST活性与模型组比较显著降低。

　　肝体指数是反映肝细胞肿胀和炎性浸润的指标，模型组肝体指数增大，说明CCl4肝损伤导致肝细胞肿胀和炎性浸润;不同浓度的CVP保护组可降低肝体指数，对抗CCl4肝损伤所致炎性浸润;VE和CVP联合应用保护作用与CVP剂量有关，以VE加150 mg CVP保护组抗炎作用最强。CCl4在肝内代谢产生自由基，攻击细胞膜结构的磷脂分子中不饱合脂肪酸产生脂质过氧化物，后者代谢的终产物MDA可直接激活Kupffer细胞，使之分泌细胞因子，再激活肝星状细胞进一步损伤肝细胞，所以MDA含量可反映自由基对肝细胞损伤程度，不同浓度的CVP保护组可降低MDA的含量;VE和CVP联合应用有协同效应。体外由硫酸亚铁和过氧化氢经Fenton反应产生羟自由基(·OH)及脂质过氧化物，在532 nm处吸光度可反映MDA的含量，不同浓度CVP保护组对体外诱导脂质过氧化物MDA产生有显著的抑制作用，CVP和VE联合应用抑制作用加强。

　　SOD和GSH是细胞内重要的抗氧化酶和还原当量，当体内代谢产生自由基时，SOD可催化超氧阴离子(O-2)反应生成过氧化氢，后者由GSH作为还原当量在谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的催化下生成水。真核细胞中SOD分布在胞液和线粒体中，胞液中存在铜锌超氧化物岐化酶(Cu，ZnSOD)，线粒体内存在锰超氧化物岐化酶(MnSOD)，其中MnSOD被认为是诱导型的，CVP增加抗氧化酶活性的机制可能是作为反式作用因子诱导MnSOD的基因表达〔7〕，不同浓度CVP保护组SOD活性高于模型组;说明CVP对肝损伤有保护作用，特别对线粒体损伤有较强的保护作用。GSH作为还原当量是谷胱甘肽过氧化物酶的辅酶，不同浓度CVP可提高GSH的含量。CVP和VE联合应用可升高SOD的活性和GSH的含量，但是SOD的活性和GSH的含量与单纯CVP保护组比较无明显差异。综上所述，CVP可通过降低CCl4肝损伤小鼠肝体指数，减轻炎性浸润，保护肝细胞膜和线粒膜的结构完整，降低血清中ALT和AST含量;诱导SOD的合成和增加GSH的含量，对抗脂质过氧化物的生成，降低MDA的含量对CCl4肝损伤有保护作用，CVP和VE联合应用有协同效应。

参考文献

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　　5 Waterfield CJ， Turton JA， Scales MD，et al. Reduction of liver taurine in rats by betaalanine treatment increases carbon tetrachloride toxicity〔J〕. Toxicology， 1993;77(12):720.

　　6 孙志强，毛远丽.肝病酶学指标及临床应用进展〔J〕.中华检验医学杂志，2005;28(6)：65963.

　　7 庞战军，陈 瑷，周 玫.云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞锰超氧化物岐化酶基因表达的调查控〔J〕.中国动脉粥样硬化杂志，1999;7(2)：1069.