Rho信号通路抑制中枢神经轴突再生的研究进展

　　　　　　作者：阚伯红 于建春 刘存志 韩景献

【关键词】 中枢神经;轴突;再生;Rho信号通路

外伤、疾病等导致的中枢神经的损伤在过去被认为是不可逆过程，近年来的研究发现，损伤后的神经组织可以通过多种方式得到修复，诸如残存神经元功能的代偿、备用通路的释放、损伤后神经纤维再生、突触重建、环路修复和干细胞移植等。Rho信号通路是生物体内重要的信号转导系统，广泛的参与细胞生长、分化、迁移和细胞发育等生命体活动。本文就抑制神经轴突再生相关的Rho信号途径加以综述。

　　1 抑制中枢神经轴突再生的微环境

　　中枢神经生长微环境是影响轴突再生的关键因素。周围神经系统的胶质细胞为雪旺细胞，而中枢神经系统则为少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞这3种神经胶质细胞，少突胶质细胞形成了中枢神经系统的轴突髓鞘。中枢神经髓鞘的存在形成一个不利于轴突生长的环境。中枢神经系统白质中的髓磷脂和少突胶质细胞中存在着抑制神经再生的物质，它们能够明显抑制成纤维细胞、神经肿瘤细胞以及原代培养神经元的黏附和轴突生长。

　　在中枢神经系统(CNS)髓鞘中有3种主要的髓鞘相关抑制因子(MAIFs)，被认为是调节抑制轴突外生的受体的配体〔1，2〕。这些抑制因子分别是勿动蛋白(Nogo)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)。拮抗MAIFs或是阻断MAIFs的信号通路，可促进中枢神经损伤后的轴突再生。其中MAG是第一个被鉴定出的具有轴突再生抑制作用的髓鞘蛋白。MAG是一种由少突胶质细胞表达与免疫球蛋白超家族唾液酸结合的亚组成员，位于轴旁周膜，可与轴突发生作用。通过DEAE柱层析法，从CNS髓鞘中分离得到的可溶性MAG可以引起生长锥的塌陷，明显抑制多种神经元突起的生长;通过免疫耗竭法除去MAG后，可明显减少髓鞘对轴突生长的抑制作用〔3〕。Mingorance等〔4〕发现在CNS损伤后，内嗅皮质层中成熟少突胶质细胞MAG mRNA呈短暂性过量表达，并且海马组织中MAG的过量表达与少突胶质细胞的增加相关，这为MAG在CNS损伤后轴突再生中的抑制作用提供了有力依据。Nogo是在髓鞘发现的跨膜蛋白，包括三种亚型A、B和C，NogoA只在CNS的少突胶质细胞表达，而NogoB和NogoC在少突胶质不表达。Oertle等〔5〕对Nogo的研究发现，Nogo上至少有三个抑制性功能区：胞外的66个氨基酸构成的疏水片段Nogo66，限制轴突的延伸并引起生长锥崩解;胞内的氨基端功能区aminoNogo，抑制纤维母细胞的增生;由NogoA专有的外显子编码的功能区，限制轴突的延伸和细胞的增生，并引起生长锥崩解。Omgp是一种与糖基磷脂酰肌醇(GPI)相结合的蛋白，在少突胶质细胞或神经元中表达，且在髓鞘中含量最少，但作用重大。在CNS发育阶段，OMgp与髓鞘的形成有关，它的表达和髓鞘形成同步。在成熟的CNS中，OMgp与髓鞘的维持有关。Wang等〔6〕发现OMgp能改变14 d鸡胚背根神经节生长锥的形态，诱使生长锥崩解并抑制神经突起生长。

　　三种结构不同的MAIFs均通过NgR发挥轴突的抑制活性。NgR是GPI锚定蛋白，位于细胞膜外侧，主要表达于CNS的神经元和轴突。由于NgR结构上缺乏胞浆部分，所以需要一个协同受体共同激活胞质内信号，抑制轴突再生。p75受体(p75NTR)是NgR的协同受体，共同免疫沉淀实验证明了p75NTR与NgR的结合共同调节所有髓质相关蛋白的抑制活性〔7〕。NgR/p75NTR协同体与Lingo1共同构成受体复合体，参与髓鞘来源的抑制因子的信号转导〔7〕。TROY是TNF受体家族成员，可以替换p75NTR形成另一种受体复合体，参与髓鞘相关蛋白的抑制活性〔8～10〕。

　　除了以上MAIFs的抑制作用外，抑制排斥分子对轴突的再生也有抑制作用， 排斥导向分子(RGM)是其中最重要者之一。RGM是分子量33 kD的GPI锚定的内质网蛋白，RGM包括三种亚型：RGMa、RGMb和RGMc。Neogenin是RGM的受体，阻止Neogenin可拮抗RGM对颞侧视网膜轴突的排斥效应〔11〕。在中和实验治疗的横断损伤鼠脊柱中，可见大量的异位纤维生出，并且长过损伤区，从而表明在成年鼠脊柱损伤后，中和RGM可增加CNS轴突的长距离再生，从而促进功能恢复〔12〕。以上各种抑制因子沟通过Rho信号通路发挥轴突再生的抑制作用。

　　2 Rho信号通路在中枢神经轴突再生抑制中的作用

　　Rho亚家族具有GTP激酶活性，包括18种以上的单体，他们多数参与细胞骨架的调整。Rho GTP激酶是大量细胞活动的主要调节子，诸如细胞生长、分化、迁移和细胞发育。RhoA、Rac和Cdc42是Rho蛋白亚家族中最有代表性的，它们在轴突外生中起重要作用，RhoA与Rac/Cdc42在神经细胞生长过程中的作用是相反的。CNS损伤后 Rac和Cdc42的活化引起丝状伪足和层状足板的形成，然而RhoA的激活与生长锥的溃变以及生长抑制相关。

　　Rho激酶(ROCK)是Rho的效应剂，分为两种亚基：ROCKⅠ(又称ROCKβ)和ROCKⅡ(ROCKα)。ROCKⅡ只表达于脑内，而ROCKⅠ主要表达于非神经组织，如肺、肾和骨骼肌等。ROCK的分子结构包括氨基端的催化结构域、中间结合Rho的α卷曲螺旋结构域和羧基端的催化结构域及Cys/His区。Rho能与ROCK的α卷曲螺旋结构域结合，激活ROCK，激活后的ROCK进一步激活其底物。

　　完整的Rho信号通路包括上游的活化受体、Rho、下游的Rock及其作用底物。

　　Rho蛋白以活化的RhoGTP形式和非活化的RhoGDP形式两种状态存在于细胞浆中。Rho受多种细胞因子的调控，鸟苷酸交换蛋白(GEPs)或鸟苷酸交换因子(GEFs)为Rho激活剂，GTP酶激活蛋白(GAPs)和GDP解离抑制因子(GDIs)为Rho灭活剂，它们分别促进和抑制Rho蛋白的活性。具体机制如下：GEFs能够使Rho释放GDP并结合GTP，GAPs能激活Rho分子本身的GTP酶活性，使GTP水解为GDP，GDIs可抑制RhoGDP和RhoGTP两种状态间的转换。在上述分子的调节作用下使Rho完成两种状态之间的转换，以实现其信号转导过程中的“分子开关”作用。

　　MAG、NogoA 和OMgp可通过NgR受体复合体将信号传入细胞内，从而导致RhoA和ROCK的活化，RhoROCK活化是轴突再生抑制中重要的分子事件。正常状况下，RhoGDI与RhoGDP结合，并隐藏在细胞质中处于静止状态。MAIFs能促进P75与RhoGDI的结合，使RhoGDP释放，在GEF的作用下，形成RhoGTP而被激活〔13〕。p75NTP活化后，p75NTP胞内的第5个α螺旋与RhoGDP结合，使RhoARhoGDP复合体募集到细胞浆膜，RhoA从复合体中解离，被RhoGEF变为RhoGTP，激活下游的ROCK。不同的轴突抑制剂均可活化RhoA，而RGM可通过非NgR复合体依赖的方式，活化RhoROCK发挥抑制作用〔10〕。

　　活化的ROCK促使生长锥的萎缩和轴突退缩，最终引起细胞骨架动力学的改变。ROCK可通过肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸激酶失活的方式，间接使磷酸化的MLC水平上调，磷酸化的MLC可刺激肌球蛋白与肌动蛋白的结合，致使肌球蛋白收缩，从而影响细胞骨架的结构。活化的肌动蛋白的解聚因子cofilin可以切断肌丝，使肌动蛋白链解聚，从而促使神经突起的基部外生〔14〕。当LIMK被ROCK磷酸化后，可使cofilin失活，继而抑制突起的外生。活化的脑衰蛋白反应调节蛋白2(CRMP2)结合微管素调节微管的组装，它的过表达可以促进轴突的延长。当CRMP2被ROCK磷酸化后，其功能失活，从而引起MAG对轴突外生的抑制效应〔13〕。

　　通过NgR/Lingo1/p75NTR或NgR/ Lingo1/TROY调节MAG、Nogo66和OMgp，通过Rho和ROCK的活化将抑制信号转导入神经元内。TROY可代替p75NTR参与信号转导。另一种来自于少突胶质细胞的轴突抑制因子RGMa通过受体Neogenin激活神经元细胞内的RhoROCK途径。最终活化下游分子MLC 、LINK和CRMP2，发挥抑制轴突外生的作用〔15〕。

　　3 针对RhoROCK途径的干预治疗

　　Rho信号通路在轴突再生中视神经损伤的在体研究表明，C3酶作用于视神经损伤区，可使Rho失活，从而引起是神经节轴突再生，并可跨过瘢痕组织〔16〕。在体脊髓损伤实验发现，在损伤区的神经细胞突起处存在大量活化的RhoA，从而激活ROCK，研究表明阻断RhoA和ROCK均可以促进轴突生长〔17〕。Monnier等〔18〕发现一种小分子物质Y27632不仅可以抑制ROCK活性，还可以阻断硫酸软骨素蛋白多糖的作用。Y27632作为ROCK的主要抑制剂，对各种原因导致的神经损伤均具有保护作用，可增加神经元细胞的存活和神经突起的延长〔19～21〕。同时，Lingor等〔22〕发现Y27632与CNTF(另一种ROCK抑制剂)联合使用更有利于神经突起的生长和再生，并有望用于临床治疗各种神经损伤及退行性病变。羟化法舒地尔作为ROCK抑制剂可为通过减少缺血脑区的血管痉挛提供神经保护作用〔23〕。ROCK抑制蛋白p21cip1/WAF1通过鞘内注射可增加脊柱半切皮质脊髓束纤维的再生、出芽和功能恢复〔24〕。活化的PKA有灭活RhoA的效应〔25〕，胞内cAMP提高后，可激活蛋白激酶A(PKA)，从而抑制Rho的效应，促进生长锥的延伸。研究证明体内注射cAMP可使脊髓和感觉神经的轴突再生〔26〕。以上表明通过抑制RhoROCK途径可促进CNS损伤后轴突的再生和功能恢复。

　　4 展 望

　　综上所述，抑制RhoA和ROCK均可提高损伤后CNS的轴突再生和功能恢复。相对于对抑制配体效果的局限性， 抑制Rho信号通路中的相关酶必将取得更好疗效。抑制RhoROCK途径的舒地尔已应用于临床，且未显示出明显的副作用〔27〕。而C3类似物已进入临床Ⅰ/Ⅱ期临床实验〔28〕。通过对中枢神经再生的抑制因素和Rho信号通路的深刻理解，必将为以后的研究及其相关临床治疗提供更多新的切入点，有望广泛用于中枢神经的损伤及退行型病变的临床治疗。

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