赤灵芝提取物对小鼠免疫功能系统的影响

　　　　　　 作者：郭雯 王英军 姜秀莲 李航

【摘要】 目的 旨在赤灵芝提取物对细胞、体液及非特异性免疫功能的影响。方法 以520、260 mg/kg赤灵芝提取物给昆明种雄性小鼠灌胃15 d，分别进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验、足跖增厚法测定小鼠迟发型变态反应、半数溶血值(HC50)测定、抗体形成细胞 (AFC) 检测、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力和网状内皮系统吞噬碳廓清功能测定。结果 赤灵芝提取物可明显增强小鼠脾淋巴细胞的转化能力(P<0.001，P<0.01，P<0.05)及体液免疫能力(P<0.01，P<0.05);明显抑制由SRBC引起的小鼠DTH反应(P<0.01，P<0.05);增强腹腔巨噬细胞吞噬功能(P<0.001);对碳廓清无明显影响。结论 赤灵芝提取物具有免疫调节作用，可明显增强小鼠脾淋巴细胞的转化能力及体液免疫能力。

【关键词】 赤灵芝水提取物;赤灵芝醇提取物;体液免疫;细胞免疫

灵芝多糖是灵芝中的主要免疫药另学活性成分，其作用主要表现在：①对正常小鼠的免疫功能具有增强作用;②增强人脐血LA K 细胞活性，且呈剂量依赖关系;③对免疫抑制药物(如氢化可的松、环孢霉素A、环磷酰胺等)和抗肿瘤药物(如氟尿嘧啶、丝裂霉素C 和阿糖胞苷等)及应激、衰老等因素所致小鼠免疫功能低下具有明显的恢复作用 〔1～3〕。本试验拟赤灵芝提取物对小鼠免疫系统的影响，为开发和利用赤灵芝的药用和保健价值提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 昆明种雄性健康小白鼠50只，体重18～22 g，由长春生物制品所提供合格证号为101001。随机分为5组，正常对照组(生理盐水)和赤灵芝水提取物低(260 mg/kg)和高剂量(520 mg/kg)组及赤灵芝醇提取物低(260 mg/kg)和高剂量(520 mg/kg)组各10只，连续灌胃15 d。

　　1.2 试剂 赤灵芝水提取物和醇提取物均为25 g生药/g粉。RPMI1640完全培养液(GIBCO产品)，小牛血清，刀豆蛋白(ConA)液均为Sigma产品，绵羊红细胞(SRBC)，豚鼠血清。

　　1.3 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)〔4〕 末次给药后1 h在超净台内，无菌取小鼠脾于无菌Hanks液培养皿内，用毛玻璃片磨碎，过滤细胞悬液，洗涤一遍，1 000 r/min，离心5 min，用2 ml RPMI1640培养液悬浮细胞，取10 μl细胞悬液，调细胞浓度至2×106/ml，加入24孔培养板，每孔1 ml/孔。实验孔加入ConA 20 μl，终浓度5 μg/ml。37℃，5%CO2孵箱内培养68 h，倒置显微镜下观察细胞形态。每孔吸去培养上清液0.7 ml，再加不含血清的RPMI1640培养液，加入MTT溶液50 μl/孔(5 mg/m1)，继续孵育4 h，加入酸性异丙醇溶液1 ml/孔，吹打混合均匀，待颗粒结晶完全溶解。将溶解液分加到96孔板中，200 μl/孔，每个样本作3复孔，酶标仪上读出OD570nm值。

　　1.4 足跖增厚法测定小鼠迟发型变态反应(DTH)〔4〕 于给药后11 d对小鼠进行致敏，每只小鼠腹腔注射2%绵羊SRBC 0.2 ml/只进行免疫，免疫4 d后，测量左后足跖部厚度，然后，在测量部位皮下注射20%(V/V)SPRC 20 μl/只，注射后于24、48 h分别测量左右足跖部厚度，同一部位测量3次取平均值。

　　1.5 半数溶血值(HC50)测定 于给药11 d对小鼠进行腹腔注2%(V/V)SRBC 0.2 ml/只进行免疫，免疫4 d后处死小鼠取血离心(2 000 r/min，10 min)，收集血清并用SA液稀释500倍，取1 ml稀释血清加入10%(V/V)SRBC 0 5 ml，补体10 ml进行血清溶血素测定，记录羊红血球的半数溶血值(HC50)。

　　1.6 抗体形成细胞(AFC) 检测 免疫方法同1.5，细胞悬液取得方法同1.3，调细胞浓度至5×106细胞/ml。空斑测定：将1%琼脂糖融化后，45℃水浴保温，与等量的2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，1 ml/管。再向管内加100 μl 10%的SRBC和40 μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾注于底层凝胶表面，制成顶层凝胶。待琼脂凝固后，置37℃放置1～1.5 h;再加10倍稀释的补体溶液1 ml，37℃放置1～1.5 h后，计数空斑形成数，用空斑数/106脾细胞来表示，受试组显著高于对照组的空斑数，即可判断该项实验结果阳性。

　　1.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力测定 末次给药后30 min，每鼠ip 20%鸡红细胞溶液1 ml/只，注射后30 min脱颈椎处死小鼠，经腹腔注入生理盐水2 ml，轻轻揉动每鼠腹部1 min，然后用吸管吸取腹腔液体l ml，均匀涂于2片载玻片上，放入垫有温纱布的搪瓷盆内，37℃水温，30 min后，生理盐水漂洗，1∶1丙酮甲醛液固定4%(V/V)Giemsa一磷酸缓冲液染色3 min，镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和计算吞噬百分率及吞噬指数;吞噬指数=(被吞噬鸡红细胞数/200个巨噬细胞)/2，吞噬百分率=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞)×100。

　　1.8 小鼠网状内皮系统吞噬碳廓清功能测定 末次给药后30 min后，尾静脉注射印度墨汁+生理盐水(2∶1)0.1 ml/10 g，注射后2、15 min与眼静脉窦取血20 μl，置于2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，7230分光光度计640 nm处比色，实验取血后处死动，剖取肝脏及脾脏称重，按下列公式计算吞噬指数K和校正廓清指数A。K=logOD1-logOD2/t2-t1，A=动物体重/(肝重+脾重)×3k。

　　1.9 统计学处理 所有数据用x±s表示，采用SPSS11.0进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组小鼠脾淋巴细胞转化能力比较 倒置显微镜下可见淋巴细胞存在，表现为体积增大，核膜清晰，核染色体疏松，核内见明显核仁2～4个，胞浆丰富，有伪足样突出。与正常对照组(0.413±0.062)比较，赤灵芝水提取物低和高剂量组及赤灵芝醇提取物低和高剂量组OD值分别为1.276±0.133、1.513±0.129、0.772±0.085和1.070±1.044(均P<0.001)，表明赤灵芝提取物明显增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力。

　　2.2 各组小鼠SRBC诱导24和48 h的小鼠DTH水平比较 表1可见，与正常对照组比较，赤灵芝提取物各组明显抑制由SRBC引起的DTH反应(P<0.05及P<0.01)。表1 各组小鼠足跖部厚度比较与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

　　2.3 各组小鼠HC50测定结果比较 与正常对照组HC50 (163.1±25.25) 比较，赤灵芝水提取物低(215.0±39.32)和高剂量组(188.97±19.23)、赤灵芝醇提取物低(200.4±115.11)和高剂量组(202.75±73.12)HC50值均明显提高(P<0.05及P<0.01)。

　　2.4 各组小鼠空斑形成数比较 与正常对照组空斑形成数(15.0±7.56)比较，赤灵芝水提取物低(70.0±21.51)和高剂量组(70.0±19.15)、赤灵芝醇提取物低(58.5±24.32)和高剂量组(40.0±14.14)均明显提高(P<0.001)。

　　2.5 各组小鼠腹腔巨噬细胞功能的测定比较 由表2可见，御惠牌赤灵芝精华各组均非常明显增加腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力(P<0.001)。表2 各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数和吞噬百分率比与正常对照组比较：1)P<0.001

　　2.6 各组小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的水平比较 由表3可见，赤灵芝提取物各组与正常对照组比较小鼠单核巨噬细胞吞噬功能均无明显差异(P>0.05)。表3 各组小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响

　　3 讨 论

　　灵芝系担子菌纲，多孔菌科，属真菌，分布于世界各地，以热带及亚热带地区较多。含有多糖、氨基酸、蛋白质、生物碱和多种化合物如三萜类及核苷酸。灵芝中有一种水溶性成分灵芝多糖，另有一种醇溶性成分三萜类物质。其子实体、菌丝体、孢子粉及灵芝水提液、多糖、蛋白均有免疫调节作用。灵芝既有提高免疫功能低下者免疫力的作用，又有抑制过高免疫水平和防止自身免疫的作用。关于灵芝增强免疫的机制，可能是灵芝提取物能有效促进脾细胞产生白细胞介素2( IL2)，增加抗体细胞的产生，促进免疫细胞增殖。灵芝可阻断过敏反应介质的释放，防止过敏反应的发生，因此，对于目前治疗较困难的变态反应性或自身免疫性疾病都可起到较好的效果，并可部分对抗某些疾病患者因长期使用激素而出现的毒副作用。已发现灵芝能促进淋巴细胞的转化与形成〔5〕，增强巨噬细胞的吞噬功能与活性〔6〕，增加NK细胞活性〔7〕，增强IL1α，IL2，肿瘤坏死因子(TNF)α〔8〕和干扰素(IFN)γ的活性〔9〕。

　　本实验证明，赤灵芝提取物可直接刺激淋巴细胞转化能力，增加抗体形成，表现为提高HC50及增加抗体形成的细胞数目，增强小鼠腹腔吞噬鸡红细胞的能力，并明显抑制由SRBC引起的小鼠DTH反应，但对小鼠碳粒清除无明显影响，这提示赤灵芝提取物可明显增强小鼠脾淋巴细胞的转化能力及体液免疫能力。实验结果表明赤灵芝子实体传统提取工艺，水提取物可做为扶正固本的免疫调节剂。同醇溶性成份比较研究并无明显差异。其中水溶性成份更适合于口服。

参考文献

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　　9 李傅毅，程丽萍，陈广洁.灵芝对小鼠淋巴B细胞分泌特异性抗体及T淋巴细胞产生γ干扰素的调节〔J〕.中国免疫学杂志，1994;10(2)：1668.