奥美沙坦通过延髓腹外侧区AT1受体减弱自发高血压大鼠血管紧张素Ⅱ引发的中枢性升压反应

　　　　 作者：张占帅 林英子 任冬月 朱杰

【摘要】 目的 探讨奥美沙坦对自发性高血压大鼠(SHR)外源性血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)引发的中枢性升压反应的影响以及与延髓腹外侧头端区(RVLM)血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)的关系。方法 实验大鼠分为SHR对照组(n=20，正常饮水)、奥美沙坦组(n=20，给予奥美沙坦30 mg·kg-1·d-1)和WKY组(n=20，WKY大鼠，正常饮水)。4 w后，三组大鼠腹腔麻醉，开颅定位RVLM后，股动静脉插管，观察注射AngⅡ前后血压和心率。采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和免疫印迹方法检测各组RVLM内AT1受体mRNA和蛋白的水平，并进行光密度测定。结果 饲养中奥美沙坦组鼠尾血压能够达标。RVLM微量注射AngⅡ后三组大鼠的平均动脉压(MAP)不同程度升高，奥美沙坦组MAP升高幅度明显低于SHR组〔(26.3±0.75)vs(47.2±1.41)mmHg，P<0.01〕，但仍高于WKY组〔(21.5±0.72)mmHg，P<0.05〕。三组大鼠心率(HR)均有所升高，但差异无统计学意义。奥美沙坦组RVLM内AT1受体mRNA平均光密度明显低于SHR组〔(0.94±0.41) vs (2.41±0.37)，P<0.01〕，但高于WKY组(0.81±0.22，P<0.05)。奥美沙坦组RVLM内AT1受体蛋白平均光密度明显低于SHR组〔(0.51±0.09) vs (0.93±0.07)，P<0.01)〕，但高于WKY组(0.43±0.03，P<0.05)。结论 长期口服奥美沙坦能够通过降低RVLM组织中AT1受体水平，显著减弱SHR RVLM区微量注射AngⅡ引起的升压反应。

【关键词】 延髓腹外侧头端;自发性高血压大鼠;血管紧张素Ⅱ1 型受体;奥美沙坦

延髓腹外侧头端区(RVLM区)是交感输出和血压调节的重要脑区，接受延髓以上心血管中枢和外周传入的多种心血管活动信息，起到维持交感紧张性和稳定血压的作用。RVLM区存在多种神经递质及其相应受体，其中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其AT1受体在该区含量丰富〔1〕。AT1受体与AngⅡ结合兴奋该区血管运动神经元引起交感活动增加，血压升高。 因此，AT1受体在RVLM区血压调节中起到关键作用。近几年研究发现高血压动物模型和高血压患者的RVLM区AT1受体密度显著增加，神经元自发活动也增加〔2〕。猜测RVLM区高度表达的AT1受体在高血压的形成和维持中起到重要作用〔3，4〕。又有研究报道，自发性高血压大鼠(SHR)的RVLM区微量注入AT1受体拮抗剂氯沙坦能够减弱静注苯肾上腺素引起的升压反应〔5，6〕，表明氯沙坦可能通过阻断RVLM区AT1受体降低血压。本课题组曾研究发现奥美沙坦能够有效减弱RVLM区微量注射谷氨酸引起的升压反应。因此，设想长期口服奥美沙坦能够通过抑制脑干心血管中枢AT1受体表达，减弱RVLM区注射AngⅡ引发的升压反应。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品和仪器 奥美沙坦(日本Sankyo公司)，AngⅡ(美国Sigma公司)，多道生理记录仪(日本Nihonkohden公司)，立体定位仪(日本Narishige公司)，微操纵仪、微量注射仪(日本Narishige公司)，微电极放大器示波仪(日本National公司)。

　　1.2 动物 SHR 40只，WKY大鼠20只(均雄性，10～12 w龄，北京维通利华动物中心)。SHR随机分成对照组和奥美沙坦组。奥美沙坦组大鼠饮用水中加有奥美沙坦(30 mg·kg-1·d-1)。对照组和WKY组大鼠正常饮水。各组大鼠均喂养4 w，每周测2次鼠尾动脉压。

　　1.3 一般手术处理 随机取SHR、奥美沙坦、WKY组大鼠各10只，乌拉坦(1.5 g/kg)腹腔麻醉。行气管插管和股动脉、股静脉插管，动脉导管连接记录平均动脉压(MAP)及心率(HR)。静脉补充20 %氨基甲酸乙酯(1 g/kg)维持麻醉。大鼠取俯卧位，头部固定于脑立体定位仪上，沿中线切开颅顶至背正中皮肤，去除部分颅骨、硬脑膜及小脑，充分暴露延髓背面。通过电热毯使肛温维持在37℃左右。

　　1.4 RVLM定位和给药 充分暴露延髓后，根据Paxinos和Watson鼠脑解剖图谱定位RVLM(以延髓闩部为参考点，RVLM在头端1.5～1.8 mm，中线旁开1.6～2.0 mm，延髓背侧表面下3.0～3.4 mm处)。将3根外径25～35 μm的注射微电极安装在注射用的微操纵仪上，尖端放置到RVLM区，经微量注射仪分别向三组大鼠单侧RVLM微量注射AngⅡ(100 pmol/50 nl)，注药速度为1.5 nmol/min，观察注药前后大鼠MAP、HR的变化。实验结束后，2%偶氮蓝染剂0.1 μl注入到显微注射部位，经左心室依次快速灌流生理盐水150 ml和4 %多聚甲醛溶液250 ml，灌注完毕迅速取脑并放置于4%多聚甲醛溶液中。用冰冻切片机将延髓作50 μm的冠状切片，中性红染色，在显微镜下寻找染点，根据Paxinos 和Watson鼠脑解剖图谱验证注射部位。 AngⅡ和定位染剂均用人工脑脊液配制。

　　1.5 测定RVLM内AT1受体mRNA水平 标本留置：取SHR、奥美沙坦、WKY组大鼠各10只，将其断头处死。对照Paxinos和Watson图谱取RVLM区脑组织，液氮速冻。

　　总RNA 提取：取200 mg脑组织，按Trizol (Invitrogen公司，美国)试剂盒说明书操作。用754 紫外分光光度计测定RNA含量。

　　RTPCR定量：取5 μl RNA经逆转录合成单链cDNA，取2 μl逆转录反应产物，94℃预变性1 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min ，30个循环后72℃延伸4 min 。取扩增产物8 μl，琼脂糖凝胶电泳成像并保存结果。引物序列见表1。表1 RTPCR引物序列

　　1.6 测定RVLM内AT1受体水平 常规方法制备脑组织蛋白样本，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转膜后，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入按比例稀释的抗AT1多克隆抗体(1∶600，Santa Cruz，USA)或抗βactin单克隆抗体(1∶650，Sigma，USA)，37℃作用1 h，TTBS洗膜，加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔(1∶1 000，Santa Cruz，USA)或山羊抗小鼠(1∶1 200，Sigma，USA)二抗，室温作用1 h后，DAB显色。

　　1.7 统计学处理 实验数据以x±s表示，应用SPSS11.0统计软件，三组间均数比较采用方差分析，两两比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组血压状况 奥美沙坦治疗4～6 d后，奥美沙坦组大鼠收缩压逐渐降至110～120 mmHg，随后血压始终保持在这个水平。SHR对照组和WKY组血压无明显变化。见图1。

　　2.2 RVLM微量注射AngⅡ后MAP和HR的变化 单侧RVLM微量注射AngⅡ后，MAP不同程度升高。2 min 时达高峰，给药后15 min时基本恢复至基线水平。奥美沙坦组MAP增幅低于SHR对照组〔(26.3±0.75)vs (47.2±1.41)mmHg，P<0.01〕，但高于WKY组〔(26.3±0.75)mmHg，P<0.05〕。注射AngⅡ后三组HR均有升高，增幅分别为SHR对照组 (29.3±0.94)、奥美沙坦组(39.5±1.66)、WKY组(38.7±2.24)次/min，经方差分析，组间差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 AT1受体mRNA的表达 各组AT1 受体mRNA扩增产物平均光密度为：SHR组2.41±0.37，奥美沙坦组0.94±0.41，WKY组0.81±0.22。SHR组与奥美沙坦组相比，差异有非常显著意义(P<0.01)，奥美沙坦组与WKY组相比，有显著性差异(P<0.05)，见图2。

　　2.4 AT1受体蛋白的表达 各组AT1 受体蛋白平均光密度为：SHR组0.93±0.07，奥美沙坦组0.51±0.09，WKY组0.43±0.03。SHR组与奥美沙坦组相比，差异有非常显著意义(P<0.01)，奥美沙坦组与WKY组相比有显著性差异(P<0.05)，见图2。

　　3 讨 论

　　近年研究发现高血压动物模型RVLM区的血压调节功能和微观分子明显受损。RVLM区明显增强的交感缩血管功能使该区对轻微兴奋性刺激就可引起强烈而持久的血压波动〔7，8〕。正如本实验中在SHR的RVLM区微量注射AngⅡ即可引起比WKY大鼠明显高的血压波动。因此，控制RVLM区亢进的交感缩血管功就有可能减弱过度的血压波动。本文观察到口服奥美沙坦能够明显减弱AngⅡ在SHR的RVLM引发的升压反应，说明奥美沙坦不仅能够阻断外周AT1受体，而且能够作用于心血管调节中枢神经元表面的AT1受体，减弱中枢升压反应。本实验又发现给予奥美沙坦4 w后SHR的RVLM区AT1受体蛋白和mRNA和水平均明显降低。这些研究结果表明口服奥美沙坦能够通过降低SHR的RVLM组织中AT1受体水平，从而减弱该区微量注射AngⅡ引起的升压反应。

　　奥美沙坦是特异性咪唑类AngⅡ受体阻断剂，对AT1受体具有高选择性和高亲和性，临床降压作用稳定、持久。本实验显示它能够作用于RVLM区神经元AT1受体，从而减弱该区注射AngⅡ引起的升压反应。但是，在正常生理情况下，奥美沙坦不易透过血脑屏障，它是通过何种途径作用于RVLM区AT1受体，进而影响中枢升压反应的机制尚不清楚。可能通过有效降低动脉血压，再通过某种反馈机制减少高血压动物RVLM区AT1受体表达。一个受体的阻断剂长期应用往往引起该受体的表达增加，本实验观察到长期应用奥美沙坦能够降低SHR的RVLM组织中AT1受体水平。这可能与RVLM区AT1受体为组织型AT1受体和其过度表达状态有关。这些有待进一步研究来证实。

　　本实验观察到SHR的RVLM区AT1受体水平明显高于正常血压的WKY大鼠，这为RVLM区AT1受体的过度表达在高血压的形成和维持中起到重要作用的观点提供了理论依据〔9，10〕。长期口服奥美沙坦能够显著降低SHR的RVLM组织中AT1受体水平，减弱外源性AngⅡ引起的中枢升压反应。故奥美沙坦可能有独立于其降低外周血压之外，有益于血压调节中枢的作用。

　　综上所述，本实验表明长期口服奥美沙坦能通过降低RVLM组织中AT1受体水平显著减弱SHR的 RVLM区微量注射AngⅡ引起的升压反应。

参考文献

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