穴位埋线与VD模型大鼠记忆障碍及海马Caspase3表达的关系

　　　　 作者：陈粲 杨琼 戴桃李 潘娅 王旭东 张敏

【摘要】 目的 探讨穴位埋线对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆的影响及可能的机制。方法 改良Pulsinelli′s四血管阻断法建立VD大鼠模型。造模后给予穴位埋线治疗，用水迷宫检测学习记忆能力，免疫组化观察海马caspase3的表达。结果 穴位埋线后VD大鼠学习记忆能力明显提高;海马caspase3在模型组中的表达明显比对照组多，而在埋线组的表达比模型组少。结论 穴位埋线改善VD大鼠的学习记忆能力，可能与其减少海马caspase3的表达、抑制神经细胞的凋亡有关。

【关键词】 穴位埋线;血管性痴呆;学习记忆;海马;caspase3

血管性痴呆(VD)至今仍无特效的治疗方法。穴位埋线是利用羊肠线对穴位的持续刺激治疗疾病，具有安全、无副作用、易行的优势，且用此法治疗VD的研究至今未见报道。本研究在制备VD模型大鼠的基础上，采用穴位埋线的治疗方法，观察该法对VD大鼠学习记忆能力的影响及可能机制，为临床治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与试剂 健康雄性SD大鼠45只，体重280～300 g(贵阳医学院动物中心提供)。caspase3试剂盒由博士德生物工程有限公司提供。

　　1.2 模型制备及治疗方法 将动物随机分为对照组、VD模型组、埋线组。采用改良Pulsinelli四血管阻断法(4VO )建立VD大鼠模型。模型组和埋线组烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。24 h后夹闭双侧颈总动脉5 min，共夹闭3次，每次间隔1 h。对照组处理步骤同上，但不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。埋线组在造模后按照图谱〔1〕定位埋线。双侧肾俞穴、足三里穴常规消毒后，用8号注射针头埋入0.5 cm长的(40)医用羊肠线，每20 d埋线1次。

　　1.3 Morris水迷宫测试 第3周开始Morris水迷宫测试。水迷宫为4个象限，在第Ⅲ象限置于一个站台。①定向航行实验：历时6 d，上午Ⅰ、Ⅱ象限，下午Ⅲ、Ⅳ象限，将大鼠从入水点放入水中，记录60 s内从入水到爬上站台所需时间即逃避潜伏期(以在站台上停留达到或超过10 s为上台，不足10 s不作为上台)。若大鼠未找到站台，引导大鼠上台并停留10 s，潜伏期记为60 s。②空间探索实验：第7天撤出站台，记录大鼠2 min内穿过原站台位置的次数。

　　1.4 免疫组织化学染色 水迷宫测试后，大鼠麻醉，经左心室插管，分别用生理盐水、10%中性甲醛灌注固定，注毕取出大脑，放入10%中性甲醛液中浸泡固定，常规脱水，石蜡包埋后行冠状位切片，片厚4～5 μm。

　　caspase3染色步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，经3% h3O2处理，热抗原修复，滴加5%BSA封闭液，滴加Ⅰ抗，湿盒内4℃孵育过夜，充分漂洗，加入相应生物素化Ⅱ抗，37℃孵育，漂洗后滴加试剂SABC，37℃孵育，PBS洗涤，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。

　　1.5 图像分析及统计学处理 用显微镜(德国Leica公司)和Mias2000图像分析系统采集图像并进行阳性细胞计数。在海马齿状回每张切片随机选取5个相邻视野，求出阳性细胞的平均值。用SPSS11.5统计软件，组间比较用单因素方差分析，统计结果以x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 穴位埋线对VD大鼠Morris水迷宫的影响 定向航行实验：大鼠在1～6 d各组平均逃避潜伏期逐渐缩短，对照组缩短最为明显(P<0.01);埋线组平均逃避潜伏期比模型组显著缩短(P<0.05，P<0.01)，见表1。提示穴位埋线可改善大鼠空间记忆。空间探索实验：模型组穿越站台位置的平均次数最少(1.27±0.70)，比对照组(5.30±1.02)有明显的定位记忆障碍(P<0.01);穴位埋线组穿越站台位置的次数(3.84±0.95)明显多于模型组(P<0.01)，定位记忆障碍有所改善。表1 Morris水迷宫定向航行实验各组平均逃避潜伏期与对照组相比：1)P<0.01;与模型组相比：2)P<0.05，3)P<0.01

　　2.2 穴位埋线对VD大鼠海马齿状回caspase3表达的影响 对照组海马齿状回有极少量caspase3阳性细胞(26.66±9.63)，胞浆内有棕黄色阳性物质;模型组海马齿状回细胞脱失，caspase3阳性细胞胞浆内棕黄色物质增多、数量增加(79.68±12.99)，与对照组比较差异显著(P<0.01);埋线组caspase3阳性细胞数减少(49.88±6.17)，与模型组比较差异显著(P<0.01)，见图1。

　　3 讨 论

　　海马是脑内与学习记忆功能关系最为密切的部位之一，也是缺血的敏感区。4VO法制备近似人类临床发病特点的、国际公认的VD大鼠模型〔2〕，造成海马缺血损伤、记忆障碍，通过穴位埋线作用，使VD大鼠学习记忆能力得到提高。

　　Caspase是一类酶原，在正常状态下以无活性的结构存在，在凋亡信号的刺激下激活为有蛋白溶解活性的一组酶，在细胞凋亡的执行阶段参与对特定死亡底物的切割。caspase3是caspase家族的核心成员，在蛋白酶级联切割过程中处于核心位置，其表达与激活在神经细胞的凋亡中具有重要作用〔3〕。结果显示caspase3在模型组中的表达明显比对照组多，因脑缺血后再灌注和长期慢性低灌流加重细胞凋亡。中医将VD归属于“健忘”、“遗忘”、“呆病”范畴，认为肾虚髓空为本，血瘀痰浊为标〔4〕。本研究选用肾俞穴、足三里穴埋线组合，通过肾俞穴益肾填髓充脑，加上足三里穴的益气健脾化痰作用，穴位埋线的刺激作用，达到扶正化痰祛痰，且以扶正为主的治疗作用〔5〕。埋穴疗法利用其特殊的针具与所埋之羊肠线，产生了较一般针刺方法更为强烈的针刺效应，有“制其神，令其易行”和“通其经脉，调其气血”的作用〔6〕。进一步的研究表明，针刺VD大鼠，可通过不同的途径兴奋不同的核团，影响不同的递质释放，如能提高乙酰胆碱、5羟色胺、脑精氨酸加压素等在脑内的含量，这些神经递质与学习的关系已被阐明〔7〕。而通过埋线作用抑制神经细胞凋亡，使埋线组的caspase3表达比模型组减少，神经细胞得到保护，学习记忆功能改善。

　　本研究结果表明，肾俞穴、足三里穴埋线改善VD大鼠的学习记忆能力，可能与其减少海马caspase3的表达、抑制神经细胞的凋亡有关。

参考文献

　　1 华兴邦，李辞蓉.大鼠穴位谱的研制〔J〕.实验动物与动物实验，1991;1：1.

　　2 Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanaesthetized rat〔J〕.Stroke，1979;10(3):26771.

　　3 Friedlander RM，Yuan J.ICE，neuronal apoptosis and neurodegeneration〔J〕.Cell Death Differ，1998;5(10):82331.

　　4 陈 刚，张六通，邱幸凡.血管性痴呆病机与治疗探讨〔J〕.现代西医结合">中西医结合杂志，2004;13(4)：545.

　　5 陈 波，吕明庄，贺志光，等.穴位埋线加灸对衰老模型鼠抗自由基氧化损伤DNA 作用的实验研究〔J〕.中国针灸，2003;23(4):237.

　　6 任晓艳.穴位埋线的源流及其机理探讨〔J〕.中国医药学报，2004;19(12)：759.

　　7 刘存志.针灸防治血管性痴呆的实验研究述评〔J〕.北京中医，2003;22(5):601.