骨髓血管内皮祖细胞的分离培养及分化鉴定

　　　　作者：宋丹 王芳 才子斌 周庆伟　王桂云 苏冠方

【摘要】 目的 研究分离、培养小鼠骨髓血管内皮祖细胞的方法并对其进行诱导分化鉴定，为临床进行缺血性疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法 用灌注法分离小鼠骨髓血管内皮祖细胞，用血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子诱导其分化，形态学观察细胞的生长过程，并利用抗CD34抗体鉴定血管内皮祖细胞，利用抗vWF抗体、抗eNOS抗体鉴定血管内皮细胞。 结果 小鼠骨髓血管内皮祖细胞可在体外培养条件下贴壁生长，可诱导分化为表达特异性组织蛋白的内皮细胞。结论 在小鼠骨髓内可分离出骨髓源性血管内皮祖细胞，呈贴壁增殖状态，并有分化能力。

【关键词】 血管内皮祖细胞;血管内皮细胞;骨髓源性;分化

　　【Abstract】 Objective To study the method of isolation ，cultivation of endothelial progenitor cells from BALB/c mice bone marrow and identification of its differentiation，to establish cytological foundation for vicariousness therapy of ischemic disease.Methods The endothelial progenitor cells were isolated by injector perfusion method from bone marrow of BALB/c mice，and induced by VEGF and bFGF，morphology method was used to observe cells growth status， anti CD34 antibody was used to test the specificity of endothelial progenitor cells，antivWF antibody and antieNOS antibody were used to identify cell′s differentiation by immunocytochemistry test.Results The status of endothelial progenitor cell from BALB/c mice bone marrow was adherence culture in vitro，and it was induced by cytokine to differentiate endothelial cell with typical morphologic and expressing tissuespecific protein. Conclusions The endothelial progenitor cell can be isolated from BALB/c mice with adherent proliferation status and has potential to differentiation.

　　【Key words】 Endothelial progenitor cells;Endothelial cells;Spinal cord;Cell differentiation

　　 骨髓中的血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)可以游走到创伤组织参加新血管形成，并能分化为内皮细胞(Endothelial cells，ECs)，促进局部血管生成和血管新生。目前已有研究者将EPCs用于治疗缺血性疾病，并取得了良好的治疗效果，具有再生和分化能力的EPCs已逐渐成为治疗血管系统疾病的理想细胞材料〔1〕。但是，目前EPCs主要通过外周血进行提取，这种方法获取的细胞数量较少，而骨髓来源的EPCs研究报道不多。本研究从BALB/c小鼠分离骨髓源性EPCs，在体外进行培养扩增，诱导其分化，建立一套完整的骨髓源性EPCs的分离、培养、诱导分化和鉴定的方法，为其作为细胞材料治疗血管创伤方面提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 BALB/c小鼠，6～8 w龄，雌雄不限，由吉林大学医学部基础实验动物部提供，SPF级;DMEM /F12 (1∶1)培养基、胎牛血清由Gibco公司提供;内皮细胞生长因子( epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)由Sigma公司提供;纤维连接蛋白(FN)由北京鼎国公司提供;抗CD34抗体、抗vWF抗体、抗eNOS、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒由博士德公司提供;6孔一次性培养板、10 cm一次性培养皿由Costa公司提供。

　　1.2 EPCs的分离与培养〔2〕 BALB/c小鼠断颈处死后，置于75%酒精浸泡灭菌5 min。无菌条件下分离股骨，去除肌肉组织，用1 ml注射器吸取1 ml无血清DMEM /F12培养基，从股骨一端进针进行冲洗，反复3次，充分冲出骨髓组织，用200目不锈钢筛网进行碾压，分离成单个细胞。用无血清DMEM /F12离心，弃上清液，2 ml无血清培养液重悬细胞加入到淋巴细胞分离液上离心，1 500 r/min，30 min。用吸管吸出中间白色云雾状细胞带，培养液洗涤2次。用DMEM /F12培养液(为基础培养基，bFGF和VEGF终浓度均为10 ng/ml)调节细胞终浓度为5×105/ml，接种到预铺有纤连蛋白10 cm培养皿，37℃、5%CO2培养箱中进行培养，每3天换液1次。

　　1.3 EPCs的诱导分化鉴定〔3〕 将培养细胞接种于预先置有盖玻片(多聚赖氨酸处理过)的6孔培养板中进行培养，并加入含bFGF和VEGF的DMEM /F12 培养基进行诱导分化，于4、20 d后分别用丙酮固定，进行免疫细胞化学染色观察EPCs的分化。具体步骤如下： 3% h3O2水孵育5 ～10 min，以消除内源性过氧化物酶活性;滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10～15 min，倾去，勿洗;滴加1∶100的一抗37℃孵育3 h，PBS冲洗(3 min ×3次) ;滴加兔抗大鼠二抗，37℃孵育10 min，PBS洗(3 min ×3次) ;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育10 min，PBS冲洗(3 min ×3次) 。DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗，脱水，透明，中性树脂封片并镜检。

　　2 结 果

　　2.1 骨髓源性EPCs的培养 从骨髓分离的细胞接种于培养基后，约2 d开始贴壁，呈梭样或三角形样增长，4 d后细胞生长速度开始增快，约10 d开始出现集落样生长状态，有梭形细胞从集落伸出，互相连接成片(图1)，约18～20 d细胞互相融合，呈铺路石样状态。

　　2.2 EPCs及ECs的细胞免疫化学鉴定 未加VEGF和bFGF的EPCs免疫化学染色显示CD34阳性反应，培养的部分细胞表面上带有均匀的棕色颗粒(图2A)。培养10 d经VEGF和bFGF诱导后，部分细胞vWF和eNOS染色均呈阳性(图2B，图2C)。

　　3 讨 论

　　当前，和老龄化密切相关的动脉粥样硬化、脑缺血、心肌缺血、脑梗死和心肌梗死等疾病发病率日益增高。研究发现，在这些疾病的恢复过程中，高龄老化引起机体血管发育能力障碍，血管生长因子合成减少，血管内皮细胞功能异常，对细胞因子的反应力也下降。目前已有动物实验研究移植EPCs治疗动脉粥样硬化和脑梗死，增加内皮细胞在这些疾病血液循环中的动员及增殖，结果表明内皮祖细胞对治疗这两种疾病有着积极的作用〔4～6〕。

　　EPCs主要来源于骨髓、外周血、脐血和胚胎，而到目前为止获取EPCs的研究大多集中在从外周血中提取，骨髓来源的EPCs研究报道为数不多。因此，本实验的目的就是从骨髓中分离培养大量EPCs，使其作为种子细胞进行移植用于缺血性疾病的细胞替代治疗和基因治疗。

　　细胞培养体系中细胞因子组成成分的不同可影响分离的单个核细胞的生长和分化。本研究中应用了细胞因子VEGF和bFGF作为EPCs的诱导分化剂。VEGF是一种可以与肝素结合的高选择度的促内皮细胞分裂素，可促进内皮细胞增生，体外培养中在一定范围内VEGF的浓度和EPSc的生长率呈正相关〔7〕。bFGF和VEGF有协同作用，主要促进内皮细胞的增殖和移行，使之增生出毛细血管样的结构，促进新生血管的产生〔8〕。两者的联合应用促进了分离的单个核细胞向内皮系统的生长和分化，证实了这是一种可行的EPCs培养方法。

　　CD34抗原是一种表达于细胞表面的糖蛋白，随着幼稚细胞的分化成熟，其表达水平逐渐下降，是EPCs的标志物之一〔9〕，本实验获得的培养4 d的EPCs CD34染色呈阳性反应，也证明了骨髓中EPCs的存在。vWF和eNOS是成熟内皮细胞的重要分子标志〔10，11〕，本文中经VEGF和bFGF诱导分化后，进行vWF和eNOS的免疫组化鉴定，染色均为阳性，进一步说明了EPCs通过VEGF和bFGF的诱导后可分化为成熟的内皮细胞。

参考文献

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