双歧杆菌上清液对D半乳糖的抗衰老作用

【摘要】 目的 通过观察双歧杆菌上清液(SCS)对D半乳糖所致亚急性衰老小鼠血脂和学习记忆行为的影响，探讨SCS降低血脂的机制，为进一步研究SCS中有效延缓衰老的成分提供理论依据。方法 小鼠颈背部皮下注射D半乳糖和生理盐水建立亚急性衰老模型和正常对照。同时，对实验组小鼠腹腔注射SCS，连续培养42 d后称重，检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDLC) 含量。结果 与模型组相比，实验组小鼠血清TG、TC水平显著降低(P<0.05)，血清HDLC水平明显提高，学习记忆能力较模型组明显提高。结论 SCS能降低血清TG、TC含量，延缓D半乳糖小鼠的衰老进程。

【关键词】 双歧杆菌上清液;D半乳糖;衰老;血脂;学习记忆

双歧杆菌上清液(spent culture supernatant，SCS)主要由双歧杆菌代谢产物组成，包括其代谢产生的有机酸、细菌素以及细胞本身的结构物质，主要成分为蛋白质和多糖。周正任等〔1〕通过有机溶剂沉淀法收集菌体外多糖(EPS)，并在体外与小肠上皮细胞内的淋巴细胞(iIEL)共同孵育，发现其对iIEL具有免疫激活作用。许多学者也曾提出SCS中存在着细菌素、黏附素等活性成分〔2～4〕，具有免疫调节、杀菌、抗衰老等多种生物作用。本研究通过观察SCS对D半乳糖所致亚急性衰老小鼠血脂的影响，探讨SCS降低血脂的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 雄性昆明株小鼠，鼠龄3个月，体重(20±2)g，由南阳医专实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂 BL培养基，酶法血清高密度脂蛋白(HDLC)试剂盒由上海求精生化试剂仪器有限公司生产。酶法血清总胆固醇(TC)试剂盒和酶法血清甘油三酯(TG)试剂盒由上海生化制药厂生产。D半乳糖购于上海恒信制药厂，批号:20010218。青春双歧杆菌由南阳医专实验中心提供。

　　1.3 仪器及设备 751 型紫外分光光度计，山东高密分析仪器厂;XHF21 高速分离器，北京医用离心机厂;XW280A 旋涡混合器，上海医科大学仪器厂;电子分析天平，上海精密科学仪器厂;电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

　　1.4 方法

　　1.4.1 SCS的制备 双歧杆菌在BL液体培养基中培养72 h后，4 000 r/min离心10 min，用 NaOH调pH 值为7.2，得SCS。4℃保存，用时复温至37℃。

　　1.4.2 实验分组及动物模型制备 随机将小鼠分为3组，每组10只。模型对照组： 每日1次定时颈背部皮下注射D半乳糖0.15 mg/g体重。正常对照组：每日1次定时颈背部皮下注射无菌生理盐水0.15 mg/g体重。以上两组同时腹腔注射无菌生理盐水0.3 ml。SCS组：每日1次定时颈背部皮下注射D半乳糖0.15 mg/g体重，同时腹腔注射SCS 0.3 ml。

　　1.4.3 观测指标及检测方法

　　1.4.3.1 动物一般情况 实验开始后密切观察各组动物的体毛、活动、进食等情况，并定时测其体重变化。

　　1.4.3.2 小鼠血清TC、TG和HDLC的测定 于第42天断颈处死小鼠，采血2 ml，酶法测定血清TC、TG、HDLC。具体方法按照试剂盒说明书进行。

　　1.5 统计学分析 计量数据用x±s表示，采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 实验动物生长情况 实验过程中各组动物均体毛光亮，活动、饮食进水正常，未出现异常死亡。各组动物体重随时间推移逐渐增加，至第6周实验结束时模型对照组体重较其余2组均低，有显著性差异(P<0.05)，3组体重顺序为正常对照组>SCS组>模型对照组，其中，SCS组和正常对照组之间体重差异不显著(P>0.05)。见表1。表1 各组小鼠实验过程中体重变化情况与模型对照组比较：1)P<0.05，下表同

　　2.2 双歧杆菌SCS对小鼠血脂指标的影响 模型对照组小鼠TG、TC水平显著高于正常对照组(P<0.05)，SCS组小鼠TG、TC水平显著低于模型对照组(P<0.05)，HDLC水平显著高于模型对照组(P<0.05)。见表2。表2 双歧杆菌SCS对小鼠血脂指标的影响

　　3 讨 论

　　根据Maillard提出的非酶促糖基化衰老学说，动物体内注射D半乳糖引起机体糖代谢障碍，在代谢过程中产生的高级糖基终末产物(AGE)可直接损伤细胞，此外，AGE还可以引起微循环障碍和缺血改变，从而进一步加重衰老进程〔5〕。糖代谢障碍及AGE的损害作用又可以引起脂类代谢的紊乱。本实验表明，D半乳糖衰老小鼠血清TC和TG的含量较正常小鼠明显升高(P<0.05)，而HDLC的含量则明显下降(P<0.05)，这与人体自然衰老时血脂的变化是一致的〔6〕。

　　TC、TG水平升高、HDLC水平下降可使动脉管壁增厚，不仅可以导致心血管疾病的发生，还可以影响机体的认知能力。杨松鹤等〔7〕通过对D半乳糖衰老大鼠抗氧化能力及血脂含量观测也证明了抗氧化能力降低、血脂代谢紊乱是D半乳糖致衰老的作用机制之一。

　　而从本实验结果来看，SCS能够有效缓解由于D半乳糖造成的血清TG、TC水平升高、HDLC降低等血脂指标的病理性改变。因此，双歧杆菌延缓衰老的机制除了通过脂磷壁酸等表面分子发挥免疫赋活作用，从而延缓免疫系统衰老之外，还可以通过促进血脂代谢，降低血清中血脂含量和脂质过氧化物的生成，延缓衰老。至于双歧杆菌调节血脂代谢的机制目前众说不一，Pigeon等〔8〕曾认为分泌胞外多聚糖的细菌能够结合更多的去结合型胆酸盐，从而提高胆酸盐的排泄，达到调节血脂代谢的目的，该机制的研究还应该得到进一步的深入和扩展。

参考文献

　　1 周正任，王 舰，杨晓临，等.双歧杆菌、大肠杆菌菌体外多糖对iIEL激活作用的对比研究〔J〕.中国免疫学杂志，2001;17(6)：296301.

　　2 Chumchalova J，Stiles J，Josephsen J，et al.Characterization and purification of acidocin CH5，a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus CH5〔J〕.J Appl Microbiol，2004;96:10829.

　　3 Deraz SF，Karlsson EN，Hedstrom M，et al.Purification and characterisation of acidocin D20079，a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM 20079〔J〕.J Biotechnol，2005;117:3434.

　　4 De Vuyst L，Avonts L，Neysens P，et al.The lactobin A and amylovorin L471 encoding genes are identical and their distribution seems to be restricted to the species Lactobacillus amylovorus that is of interest for cereal fermentations〔J〕.Int J Food Microbiol，2004;90：93106.

　　5 Song X，Bao M，Li D，et al.Advanced glycation in Dgalactose induced mouse aging model〔J〕.Mech ageing Dev，1999;108(3):23951.

　　6 Yoshiga CC，Higuchi M，Oka J.Serum lipoprotein cholesterols in older oarsmen〔J〕.Eur J Appl Physiol，2002;87(3):22832.

　　7 杨松鹤，董晓彤，杨国军，等，D半乳糖衰老大鼠抗氧化能力及血脂含量的观测〔J〕.承德医学院学报，2005;22(2)：99101.

　　8 Pigeon RM，Cuesta EP，Gilliland SE.Binding of free bile acids by cells of yogurt starter culture bacteria〔J〕.J Dairy Sci，2002;85:270510.