RNAi沉默EGFR基因对卵巢癌放疗敏感性的影响

　　　　 作者：林远洪 吴永忠 李少林 郭启帅 罗茜

【摘要】 目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌放疗敏感性的增强作用。方法 构建针对EGFR基因序列特异性短发夹状RNA(shRNA)表达载体，应用卵巢癌SKOV3细胞建立裸鼠移植瘤模型，随机分为对照组、单纯放疗组、基因放疗组，采用6 MV X线照射裸鼠瘤组织，监测瘤体积，测量瘤质量，取瘤组织行RTPCR、Western印迹、免疫组化、电镜检测。结果 治疗后三组瘤体积差异均显著(均P<0.01)，单纯放疗组、基因放疗组的抑瘤率分别为28.1%、46.1%，基因放疗组EGFR基因的表达明显下调，透射电镜下瘤组织凋亡、坏死最明显。结论 动物实验证实RNAi沉默EGFR基因明显提高卵巢癌的放疗敏感性。

【关键词】 EGFR基因;RNA干扰;放疗;卵巢癌

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene on the radiosensitivity of ovarian cancer by RNAi technology. Methods EGFR gene sequencespecific shRNA expression vector were constructed. Tumoranimal model with ovarian cancer SKOV3 cells were established and the nude mice were randomly pided into control， radiotherapy and generadiotherapy groups. The ovarian cancer tissue was irradiated by 6 MV Xray. Tumor volume and tumor weight were measured. RTPCR， Western blot， immunohistochemistry and electron microscopy were used to detected cancer tissue. Results There were obvious difference among three groups in tumor volume (P<0.01). The inhibitingtumor rate of the radiotherapy and the generadiotherapy groups were 28.1% and 46.1% respectively. The expression of EGFR gene in generadiotherapy group was significantly decreased and the tumor cell apoptosis， necrosis were all obvoius.Conclusions Silenced EGFR gene by RNAi can significantly improve the radiosensitivity of ovarian cancer.

　　【Key words】 EGFR gene;RNA interference;Radiotherapy;Ovarian cancer

　 表皮生长因子受体(EGFR)的高表达与肿瘤恶性程度、转移、放化疗敏感度下降密切相关，可作为诊断及判断预后的指标，许多阻滞和下调EGFR的方法被用来抑制肿瘤增殖以改善预后，并已显示出初步疗效及良好的安全性，因此EGFR成为目前公认的肿瘤基因治疗的重要靶位〔1〕。本实验选择放疗相对不敏感的卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，以目前分子靶向治疗中的EGFR基因为靶点，采用RNA干扰(RNAi)技术，探讨EGFR基因与卵巢癌放疗敏感性的关系，实验初步显示了RNAi技术在卵巢癌基因放疗中的潜在作用，为肿瘤治疗提供新策略。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料 卵巢癌SKOV3细胞株购自中科院上海细胞生物研究所;BALB/C雌性裸鼠购自北京维通利华公司。脂质体lipofectamine2000购自Invitrogene公司;去内毒素质粒提取试剂购自Omega公司;鼠抗EGFR单克隆抗体购自Santa Cruz公司;蛋白提取试剂盒购自赛百盛公司;免疫组化试剂盒及SDSPAGE凝胶购自博士德公司;总RNA提取试剂购自华舜公司;RTPCR试剂盒购自宝生公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 靶向EGFR基因shRNA表达载体的构建 根据siRNA的设计原则及质粒载体pGenesil的多克隆位点特点，选择EGFR家族同源性基因片段(TGGGGTCGTCAAAGACGTT)为模板，利用美国Dharmacon公司siRNA设计软件，获得靶向EGFR基因序列特异性shRNA的质粒载体(pGenesilEGFR)：正义链：5′UGGGGUCGUCAAAGACGUU3′;反义链：5′ACCCCAGCAGUUU

　　CUGCAA3′;以此序列为基础，中间加入CUAUGGACA茎环序列将其分隔为反向重复序列，两端加上BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，送武汉晶赛生物工程公司合成。

　　1.2.2 建立卵巢癌移植瘤模型 采用常规培养细胞种植法，取对数生长期的SKOV3细胞，制成4×107个/ml的细胞悬液，取0.3 ml接种于每只BALB/C裸鼠右肩胛皮下，观察肿瘤生长情况。3 w后将成瘤裸鼠随机分为对照组、单纯放疗组、基因放疗组，每组6只。

　　1.2.3 照射裸鼠瘤组织 每组采用瘤内及瘤周多点注射，对照组：脂质体10 μg +转染液(总量200 μl)，单纯放疗组：脂质体10 μg +转染液(总量200 μl)，基因放疗组：脂质体10 μg+ pGenesilEGFR 40 μg+转染液(总量200 μl)，连续注射3 d后开始放疗，放疗期间每3天注射一次，采用医用直线加速器(Varian公司)6 MV X线源皮距放疗，100 cGy/d，总量1 000 cGy。放疗前及放疗期间每3天测量肿瘤体积，肿瘤近似体积(V)=单纯放疗组/6(abc)，单位mm3，a.b.c分别为肿瘤结节的长度、宽度、高度。放疗后处死裸鼠，测量瘤块质量，计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100%。

　　1.2.4 RTPCR检测EGFR mRNA的表达 分别取3组瘤组织各40 mg，提取总RNA，取定量好的RNA 5 μl，合成cDNA，再通过PCR扩增，EGFR引物序列：P1(上游)5′AGGAGTGCGTGGAGGAAT3′、P2(下游)5′CTGCCGTCGCTTGATGAG3′，扩增产物为425 bp;同时选取GAPDH作为内参照，GADPH引物序列：P1(上游)5′AGGTCCACCACTGACACGTT3′、P2(下游)5′GCCTCAAGATCATCAGCAAT3′，扩增产物大小约310 bp。(PCR反应参数：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳检测)。目的条带采用凝胶成像分析系统测定各条带的灰度值，以EGFR与GAPDH条带灰度值的比值作为EGFR mRNA的相对表达水平，EGFR mRNA表达抑制率(%)=(1-实验组EGFR mRNA相对表达水平/对照组EGFR mRNA相对表达水平)×100%。

　　1.2.5 Western印迹检测EGFR蛋白的表达 分别取三组瘤组织各20 mg，提取蛋白;取经处理的蛋白样品各15 μl进行电泳;电转至PVDF膜;取下PVDF膜进行杂交，以βactin作为内参照;化学发光试剂检测;放射自显影。检测用LabworksTM扫描分析软件检测EGFR和βactin的积分光密度值，以EGFR与βactin光密度值的比值作为EGFR蛋白的相对表达水平，EGFR蛋白表达的抑制率%=(1-实验组EGFR蛋白相对表达水平/对照组EGFR蛋白相对表达水平)×100%。

　　1.2.6 免疫组化检测EGFR蛋白的表达 标本用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，连续4 μm切片，步骤按说明进行，DAB染色剂显色，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性标本作阳性对照，阳性产物为棕黄色或棕褐色，并呈颗粒状，背景呈紫蓝色。

　　1.2.7 电镜观察瘤组织形态 新鲜标本取材后用2.5%戊二醛固定，常规包埋，超薄切片，定位，透射电镜下(重庆医科大学电镜室，H7500透射电镜)观察肿瘤组织形态，凋亡等。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件，数据以x±s表示，计量资料用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 肿瘤体积变化 见表1，开始治疗时3组间瘤体积差异不显著(P>0.05)，治疗后3组间差异显著(P<0.01)，单纯放疗组与基因放疗组抑瘤率分别28.1%，46.1%。表1 放疗期间三组瘤体积变　1)与对照组比较，2)与单纯放疗组比较：P<0.01

　　2.2 RTPCR检测EGFR mRNA的表达 见图1，基因放疗组中EGFR mRNA(425 bp)的亮度明显低于单纯放疗组及对照组，而内参GADPH mRNA(310 bp)在三组中的亮度相似，基因放疗组(0.317±0.071)与对照组(1.244±0.119)、单纯放疗组(1.179±0.086)差异显著(P<0.01)，基因放疗组的EGFR mRNA表达抑制率为74.5%。

　　2.3 EGFR的蛋白表达 见图2，基因放疗组中EGFR蛋白(170 kD)表达的强度明显弱于单纯放疗组及对照组，而内参βactin(42 kD)在三组中的强度相似，基因放疗组(0.254±0.034)与对照组(0.806±0.064)、单纯放疗组(0.781±0.039)差异显著(P<0.01)，基因放疗组EGFR蛋白表达的抑制率为68.5%。

　　2.4 免疫组化检测结果 见图3，EGFR蛋白在单纯放疗组及对照组中呈强阳性表达，胞膜及胞浆内见到大量棕黄色或棕褐色颗粒，而在基因放疗组中呈弱阳性表达或不表达，胞膜及胞浆内见少量棕黄色或棕褐色颗粒。

　　2.5 电镜结果 电镜超微结构，图4，卵巢癌细胞质丰富、核仁明显、核分裂象多、核浆比大，放疗组较对照组肿瘤组织呈明显坏死改变，部分胞膜、核膜溶解、细胞核固缩、细胞缩小、染色质浓缩、可见典型凋亡小体等，尤以基因放疗组最明显。

　　3 讨 论

　　RNAi是指由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过具有序列特异性的双链RNA(dsRNA)或短发夹状RNA(shRNA)与靶基因mRNA结合而导致目的基因表达下调，细胞表现出特定基因缺失的表型〔2，3〕。新近研究发现，RNAi在应用过程中，小片段干扰RNA(siRNA)可通过与目的基因具有同源性的其他mRNA结合，或者与细胞的蛋白结合，产生非特异作用，即脱靶效应导致基因沉默特异性降低〔3〕，相对传统的基因治疗，RNAi具有高效性、高特异性、高稳定性、可遗传性、可扩散性等特点，目前RNAi在癌基因组功能研究和肿瘤基因治疗中已显示出强大的效果，siRNA表达载体因具有简便、快速、成本低、转染效率高，便于稳定筛选等优点，极大促进了RNA干扰技术的应用〔4〕。

　　卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，近年发病率呈上升趋势，卵巢癌发病隐匿，确诊时多为中晚期，目前卵巢癌虽综合了手术、化疗、放疗、免疫、热疗等多种手段，但疗效并不乐观。近年来随着分子生物学的发展，有学者研究表明70%以上的卵巢癌组织中有EGFR高水平表达〔5，6〕，EGFR在恶性肿瘤中过表达，使癌细胞抵抗电离辐射〔7〕，导致放疗失败。

　　本课题将RNAi技术与目前国际上有关辐射信号转导途径的研究结合起来，采用RNAi技术阻断导致辐射抗拒性的信号转导途径上的关键基因家族，深入探讨RNAi技术增敏放疗的内在分子机制。实验选择放疗相对不敏感的卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，以目前分子靶向治疗中的EGFR基因为靶点，探索其对卵巢癌放射敏感性中的影响，根据siRNA的设计原则，构建了序列特异性的shRNA的质粒载体，通过建立卵巢癌移植瘤模型，采用医用直线加速器源皮距照射瘤组织，观察到基因放疗组裸鼠体内移植瘤生长明显缓慢;通过RTPCR、Western印迹、免疫组化检测到EGFR基因的mRNA和蛋白的表达明显抑制，证实序列特异性的EGFR shRNA能显著抑制EGFR基因的表达，使EGFR介导的细胞信号转导通路被阻断，抑制了EGFR基因的恶性生物学行为，提高了卵巢癌放疗的敏感性，证实了放疗敏感性的提高与EGFR基因的沉默相关。

　　放疗作为目前肿瘤综合治疗的手段之一，在杀伤肿瘤细胞的同时，不可避免的会引起正常组织的损伤，因而影响了放疗的效果。肿瘤的基因放疗在增强放射治疗效应的同时减少放疗的不良反应，是肿瘤治疗学领域一种非常重要的发展趋势〔8〕，基因放疗在给人们带来鼓舞的同时还有很多问题需要进一步探讨。

参考文献

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　　2 Kim VN.Small RNAs：classification，biogenesis and function〔J〕.Mol Cells，2005;9(1):115.

　　3 Tomari Y，Zamore PD.Perspective：machines for RNAi〔J〕.Genes Dev，2005;19(5):51729.

　　4 Paddison PJ，Candy AA，Bemstein E，et al.Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence specific silencing in mammalian cells〔J〕.Genes Dev，2002;16:94858.

　　5 Nielsen JS，Jakobsen E，Holund B，et al.Prognostic significance of p53，Her2，and EGFR over expression in borderline and epithelial ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer，2004;14(6):10867.

　　6 Alper O，Bergmann Leitner ES，Bennett TA，et al.Epidermal growth factor receptor signaling and the invasive phenotype of ovarian carcinoma cells〔J〕.J Natl Cancer Inst，2001;93(18):1375.

　　7 Iiang K，Ang KK，Milas L，et al.The epidermal growth factor receptor mediates radioresistanee〔J〕.Int J Radiat Oneol Biol Phys，2003;57(1):246.

　　8 Collis SJ，De Weese TL.Enhanced radiation response through directed molecular targeting approaches〔J〕.Cancer Metastasis Rev，2004;23(3):27792.