呆聪液对痴呆大鼠模型脑内β淀粉样前体蛋白基因表达的影响

　　　　　　 作者：岳启安 赵淑梅 王红艳

　　　　　　阎乐法 汲蕊 宫英 尤敏 管福来 钱震雯

【摘要】 目的 探讨呆聪液对痴呆大鼠模型脑内β淀粉样前体蛋白(βAPP)基因表达的影响。方法 22月龄SD大鼠采用海人酸破坏脑基底核法造成学习和记忆功能障碍的痴呆动物模型。造模后的大鼠随机分为痴呆模型组、呆聪液(低、中、高剂量)组，同时设正常对照组，每组10只。呆聪液低、中、高剂量组每日呆聪液灌胃(低5 g/kg、中10 g/kg、高20 g/kg)，痴呆模型组和正常对照组每天用生理盐水(10 ml/kg)灌胃，共1个月。通过水迷宫法和反转录聚合酶链反应观察呆聪液对痴呆模型大鼠学习记忆能力和脑内βAPP基因表达的影响。结果 老龄痴呆模型大鼠学习记忆能力下降，脑内βAPP基因表达增强。呆聪液高、中、低剂量组能明显提高学习记忆能力，降低脑内βAPP mRNA含量，并有一定的量效关系，与痴呆模型组比较差异有显著性(P<0.05)。结论 呆聪液能改善老龄痴呆大鼠的学习和记忆功能，下调βAPP基因的表达。

【关键词】 呆聪液;海人酸;动物痴呆模型;β淀粉样前体蛋白;基因表达

研究表明，老年痴呆患者都有脑底动脉硬化、海马区额叶老年斑及神经元纤维缠结的病理变化。中枢meynert基底核神经元缺失伴胆碱能神经元功能障碍，海马区胆碱乙酰转移酶活性降低，可出现不同程度的脑萎缩。因此，中枢胆碱能神经功能障碍与痴呆程度密切相关。为进一步阐明呆聪液治疗老年痴呆的作用机制，本文在研究呆聪液对老龄鼠痴呆模型脑M受体及免疫功能影响的基础上〔1〕，探讨呆聪液对老龄鼠痴呆模型脑M受体基因及β淀粉样蛋白(Aβ)受体基因表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 选用22月龄SD大鼠50只，体重250～300 g，雌雄兼用，由山东大学医学院动物试验中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 药物、试剂与仪器 呆聪液主要为人参、生地、知母、黄芪等组成，按中药水提液的制备工艺加工制成，每毫升含生药1 g，由潍坊医学院附属医院药剂科配制加工而成;海人酸由潍坊医学院生理教研室李秀艳教授馈赠;3%戊巴比妥钠、乙醚、75%酒精、3%戊二醛、1%锇酸等。江湾Ⅱ型立体定位仪，PCR仪(美国)，凝胶成像分析系统(美国FOTODYNE公司)，电泳仪(美国)。

　　1.2.2 模型制备 将SD大鼠先用3%戊巴比妥钠腹腔内麻醉，然后固定于江湾Ⅱ型立体定位仪上，经消毒后正中矢状切口，按照文献〔2〕方法大鼠脑图谱于前颅前2 mm中线旁开2.5 mm处用自制打孔钻打开颅骨一小孔，固定移动装置，垂直进入微型注射针头7～8 mm(即相当于基底核区)，轻轻注入1 μg海人酸(1 μg/μl)，静留针1～2 min后，缓慢移动装置退针，先用石蜡粉溶化后封住颅骨开口，再在封口上撒适量青霉素和链霉素粉剂后缝合皮肤。

　　1.2.3 给药方法 将造模后的大鼠随机分为痴呆模型组、呆聪液低剂量组(5 g/kg)、中剂量组(10 g/kg)、高剂量组(20 g/kg)，每组10只，同时设正常对照组。每日呆聪液各剂量组灌胃相应剂量呆聪液，痴呆模型组和正常对照组用生理盐水(10 ml/kg)灌胃，1个月后取脑标本。

　　1.2.4 检测指标 参照Trizol试剂说明书方法提取大鼠脑细胞总RNA，紫外分光光度法测定总RNA浓度，A260 nm/A280 nm为1.8～2.0，提取总RNA于-70℃保存。引物的设计与合成：β淀粉样前体蛋白(βAPP) mRNA，βactin 通过Http://www.ncbi.nlm.nih.gov获得cDNA序列，采用Primer 5引物设计软件，获得PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。βAPP上游引物：(5′3′)AATCCTGCAGTACTGCCAAG，下游引物：(5′3′)TGGCAACAGTACTGCCAAG;βactin上游引物：(5′3′)CAACTTTACCTTGGCCACTACC，下游引物：(5′3′)TACGACTGCAAACACTCTACACC，产物150 bp。RTPCR：用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0。取适量总RNA稀释至160 μg/ml，65℃变性3 min后，配置反转录反应液：MgCl2 2 μl，10×RT Buffer 1 μl，RnaseFree dh3O 3.75 μl，dNTP Mixture 1 μl，Rnase Inhibitor 0.25 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl，Random9 mers 0.5 μl，RNA 1 μl。30℃反应10 min，42℃反应30 min，99℃反应5 min，5℃反应5 min;PCR反应液组成：5×PCR Buffer 10 μl，灭菌蒸馏水28.75 μl，TaKaRa Ex TaQTMHS 0.25 μl，上游特异性PCR引物0.5 μl，下游特异性PCR引物0.5 μl，反转录反应液10 μl，总体积为50 μl， PCR反应条件：94℃变性2 min后，βAPP的PCR循环条件：94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min;βactin的PCR循环条件为94℃变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸1 min，完成35个循环后，取PCR产物8 μl在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，5 V，45 min，用自动成像仪(美国FOTODYNE公司)观察拍照。重复实验的电泳图谱用STORM 860荧光扫描分析仪(美国DYNAMIC公司)分析，相对表达量根据各电泳区带与内对照βactin的面积之比来计算。以βactin为内参照，按公式βAPP/βactin计算βAPP mRNA水平。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，使用SPSS10.0统计软件处理。

　　2 结 果

　　痴呆模型组βAPP mRNA的表达量(1.551±0.054)较对照组(1.483±0.005)明显升高(P<0.05)，呆聪液低、中、高各剂量组βAPP mRNA表达量分别为1.476±0.007、1.380±0.005、1.382±0.004，与痴呆模型组比较明显降低(P<0.05)。RTPCR扩增产物琼脂糖电泳结果显示呆聪液中剂量组效果最佳(图1)。

　　1.Marker 2.空白对照组 3.痴呆模型组 4.低剂量中药组 5.中剂量中药组 6.高剂量中药组

　　图1 RTPCR扩增产物琼脂糖电泳图

　　3 讨 论

　　老年痴呆是一种记忆能力减退、认知功能障碍、行为异常为特征的脑退行性疾病。近年研究发现，环境和基因突变导致APP代谢异常，在神经元细胞外产生Aβ沉积，并造成神经元损伤〔2〕。Lin等〔3〕研究发现，大脑皮层胆碱能系统功能的完整性对保持正常的APP 水平和调节APP代谢有重要意义。APP 水平的升高与胆碱能活性下降有关，对那些大脑胆碱能系统核基质受损的大鼠用N甲基D天门冬氨酸盐处理，能提高APP的mRNA水平和合成APP的能力。许多研究还证实，老年痴呆与神经细胞的氧化应激有关，Aβ可以增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生〔4〕，ROS又反过来促进氧化应激反应，产生脂质过氧化物，引起蛋白质和DNA的功能改变，最终导致神经细胞死亡〔5〕。为了进一步研究老年痴呆病的发病机制及临床中药混合制剂呆聪液的作用机制，本研究利用海人酸制备老龄大鼠痴呆模型进行了中药呆聪液对痴呆大鼠模型脑内βAPP基因表达影响的探讨，结果显示痴呆模型组能明显提高脑内βAPP基因表达水平，使学习记忆能力显著下降。中药呆聪液能显著改善老龄大鼠的记忆力和学习功能。呆聪液的三个不同剂量组虽然都能抑制脑内βAPP基因表达水平，但是中剂量组效果最佳。在改善学习记忆能力的同时，抑制了βAPP基因的转录，降低了βAPP mRNA的含量，并表现出一定的量效关系。

参考文献

　　1 岳启安，赵淑梅，高敬宗，等.呆聪液对老龄大鼠痴呆模型脑M受体作用的实验研究〔J〕.中国西医结合">中西医结合杂志，2000;20(11)：8468.

　　2 刘建辉.早老性痴呆病——淀粉样蛋白Aβ研究进展〔J〕.生物医学工程学杂志，2003;20(2)：3714.

　　3 Lin L，Georgievska A，Mattson A，et al.Cognitive changes and modified processing of amyloid precursor protein in the cortical and hippocampal system after cholinergic synapse loss and muscarinic receptor activation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(21):12108.

　　4 Butterfield DA，Martin L，Carney JM，et al.Amyloid βpeptide displays h3O2like reactivity towards aqueous Fe2+，nitroxide spin probes and synaptosomal membrane proteins〔J〕.Life Sci，1996;58:217.

　　5 Beckman JS，Chen J，Crow JP，et al.Reaction of nitric oxide，superoxide and peroxynitrite with superoxide dismutase in neurodegeneration〔J〕. Prog Brain Res，1994;103:371.