抑胶素对大鼠脑胶质瘤增殖细胞核抗原表达的影响

　　　　 作者：姜慧轶 林卫红 马涤辉 刘仕成 崔俐

【摘要】 目的 研究抑胶素对大鼠脑胶质瘤增殖细胞核抗原的影响。方法 采用鼠脑立体定向的方法建立大鼠脑胶质瘤动物模型并进行分组：抑胶素不同浓度实验组(Ⅰ：8 μg/kg;Ⅱ：16 μg/kg;Ⅲ：32 μg/kg;Ⅳ：64 μg/kg)、对照组，于治疗14 d后计算瘤体变化，应用免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，观察瘤细胞增殖变化情况。结果 抑胶素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组对C6脑胶质瘤细胞有显著抑制作用，其瘤体积及抑瘤率与对照组比较有统计学差异(P<0.05，P<0.01);抑胶素能够使胶质瘤PCNA指数下降，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组PCNA指数(%)与对照组相比较有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。结论 抑胶素能够抑制大鼠脑胶质瘤体内生长。其机制之一可能与胶质瘤内PCNA表达，使肿瘤细胞增殖水平下降有关。

【关键词】 抑胶素;脑胶质瘤;增殖细胞核抗原

神经胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，是颅内肿瘤中最常见的一种，因其侵袭性生长的特性，手术难以完全切除，复发率极高，因此，寻求一种高效低毒、特异性高、不易发生耐药的抗胶质瘤药有重要意义。抑胶素(antigliomatin)作为一种特异性氯离子通道阻滞剂，是一种蝎毒素多肽。为观察其抑瘤效应及探讨其抗肿瘤的作用机制〔1〕，本研究观察了其对大鼠脑胶质瘤形态学的影响及对脑胶质瘤细胞增殖细胞核抗原的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株和实验动物 大鼠C6脑胶质瘤细胞株是由雄性大鼠静脉注射硝甲基脲而诱发产生的恶性胶质瘤细胞株。本实验所用的瘤株由吉林大学病理毒理学教研室提供。抑胶素由吉林大学基础医学院生理教研室提供。动物选用雄性、健康Wistar大鼠50只，鼠龄6～8 w，体重200～250 g，由高新技术开发区动物中心提供。

　　1.2 细胞培养〔2〕 将C6大鼠脑胶质瘤细胞株复苏成功后，接种于25 cm2培养瓶中，采用单层贴壁培养法。将复苏后的C6胶质瘤细胞加入含10%灭活小牛血清的IMDM培养液中，置于含5%CO2、37℃恒温密闭式孵箱中培养，每周传代2次。当细胞增殖进入对数阶段，培养瓶细胞长满时，先倒去培养液，用0.25%胰酶溶于不含Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液中消化细胞，在显微镜下观察到细胞开始皱缩时加入营养液中和，反复吹打，使之脱壁，1 000 r/min离心5 min，弃上清，制成细胞悬液。体外培养的C6胶质瘤细胞爬片常规应用免疫组化(SABC法)检测GFAP蛋白的表达，阳性细胞胞浆呈现棕黄色着染。

　　1.3 接种方法 收集对数生长期生长状态良好的C6细胞，细胞浓度为2.0×106/10 μl，经MTT法检测细胞存活率达90%以上。以2.0×106个细胞/只鼠的量接种，所有的大鼠均采用立体定向方法进行接种。根据Barker法确定切口和钻孔位置，在大鼠脑立体定位仪上选取大鼠脑右侧尾状核区为靶点，从头部正中矢状面交点向后纵向切开皮肤，暴露颅骨标志，按前述坐标点定位，用牙科钻在颅骨上钻孔，孔径1.2 mm，用10 μl的微量注射器针头锐性刺破硬膜在立体定向引导下接种针垂直缓慢延伸至硬膜下6.0 mm，再后延1.0 mm于硬膜下5.0 mm靶点处，将10 μl细胞悬液以1 μl/min缓慢注入靶区，留针5 min，使细胞充分沉积，缝合头皮。每只大白鼠每天给予青霉素10万U腹腔注射共5 d以预防感染。

　　1.4 动物分组 荷瘤7 d后将全部Wistar大鼠随机分为5组，每组10只。以不同浓度抑胶素灌胃治疗14 d，具体如下：(1) 空白对照组：用生理盐水对照;(2)实验组：抑胶素不同浓度组(Ⅰ：8 μg/kg;Ⅱ：16 μg/kg;Ⅲ：32 μg/kg;Ⅳ：64 μg/kg)。

　　1.5 观察用药前后肿瘤体积变化、计算抑瘤率 用药后活体灌注4%多聚甲醛固定肿瘤标本，沿脑表接种穿刺点做冠状切口，测量肿瘤大小，肿瘤体积=a2×b×π/6(a为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径)。抑瘤率=(对照组肿瘤的平均体积-实验组肿瘤的平均体积)/对照组肿瘤的平均体积×100%，抑制率≥30%为肿瘤对药物敏感。

　　1.6 免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白 采用SABC法，石蜡切片脱蜡至水，3%双氧水阻断10 min，微波修复抗原10 min。10%正常山羊血清封闭非特异性抗原室温下60 min。倾去血清，加1∶100稀释的PCNA，置湿盒内4℃过夜。PBS冲洗5 min×3次，滴加生物素化二抗工作液，加盖湿盒内室温下60 min。PBS振洗5 min×3次。加入SABC复合物，室温下60 min，PBS振洗5 min×4次。DAB显色液显色。苏木素衬染3 min。自来水冲洗，酒精水化，二甲苯透明，中性树胶封片。正常脑组织为正常对照，结果以胞核或(和)胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，高倍视野下(400倍)阳性细胞数所占总肿瘤细胞的百分率即为PCNA标记指数(LI)。

　　1.7 统计学分析 采用SPSS统计分析软件，计量资料采用x±s表示，并计算抑瘤率，然后进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 实验大鼠的肿瘤体积和抑瘤率的变化 活体灌注4%多聚甲醛固定肿瘤标本，沿脑表接种穿刺点做冠状切口，测量肿瘤大小，计算出各实验组的抑制率，并与对照组做比较，用完全随机设计两总体均数比较的t检验对所测得的肿瘤体积大小进行统计学处理、分析。由表1可以看出：实验组Ⅰ肿瘤体积与对照组相比无统计学意义(t=0.86，P>0.05);实验组Ⅱ～Ⅳ与对照组相比有显著差异(P<0.05，P<0.01)，并且随抑胶素浓度增大，瘤体积缩小越明显，抑瘤率也随抑胶素浓度增高而增加，实验组Ⅰ组与Ⅱ组比较无统计学差异(P>0.05)，其余各组两两比较有显著性差异(P<0.05)。见表1。

　　2.2 PCNA免疫组化结果分析 PCNA阳性细胞的胞核呈黄色或棕黄色，镜下计数肿瘤内5个视野的阳性细胞。对照组肿瘤细胞中PCNA蛋白阳性表达率平均为72.18%，表现为阳性细胞密度高，胞核呈强阳性，数量多。经抑胶素治疗后即可见肿瘤内PCNA阳性细胞密度下降，核PCNA阳性强度减弱，随浓度增加阳性率呈下降趋势。实验组Ⅱ～Ⅳ PCNA指数较对照组有显著差异(P<0.05，P<0.01)。实验组Ⅰ与对照组PCNA蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验组Ⅰ组与Ⅱ组比较无统计学差异(P>0.05)，其余各组两两比较有显著性差异(P<0.05)。见表1。表1 不同浓度抑胶素组治疗前后瘤体积、抑瘤率及PCNA指数变化与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

　　3 讨 论

　　抑胶素的有效成分是氯毒素(chlorotoxin)，有研究表明Cl通道参与了星形细胞瘤生长的调控〔3〕;1998年，Soroceanu等〔4〕报道了氯毒素多肽在神经胶质瘤动物模型上靶向脑瘤组织的研究。结果显示，动物注射125I和131I标记的氯毒素后，放射性选择性地累积在动物脑部的肿瘤内。以上结果表明，由于GCC在人体神经胶质瘤细胞中选择性产生，且产生量与肿瘤的恶化程度呈正相关。Sontheimer〔5〕将放射性的碘和一种植物毒素连接在氯毒素上，借助氯毒素的特异靶向作用将它们带到神经胶质瘤动物模型肿瘤内，结果药物只选择性杀死肿瘤。目前，尚未见国内使用研制开发的氯毒素类物质对C6鼠脑胶质瘤作用的研究报道，因此对于此类药物的研究及开发具有广阔的应用前景。本研究结果显示，不同浓度抑胶素组均有抑制瘤体生长作用，其中实验Ⅰ组肿瘤体积及抑瘤率与对照组相比无统计学意义;实验Ⅱ～Ⅳ组与对照组相比有显著差异，并且随抑胶素浓度增大，瘤体积缩小越明显，抑瘤率也随抑胶素浓度增高而增加，提示抑胶素具有抑制肿瘤生长作用。

　　PCNA是一种分子量为36 kD的多肽，仅在增殖细胞中合成与表达，在细胞周期S期合成最高，是存在于细胞核内的酸性蛋白，其表达水平与细胞的增殖有关，目前认为它是S期细胞的标志物。用免疫组化方法标记PCNA，并通过计数其阳性细胞而得到的PCNA指数被认为是评价和反映细胞增殖水平的客观指标。PCNA指数越高，意味着处于S期的细胞越多，亦即染色体排列紊乱的危险性愈高〔6〕。因此PCNA被用于研究恶性肿瘤的细胞增殖和判断其恶性程度，它对肿瘤的治疗及预后的判断有重要意义。

　　本实验结果显示，经抑胶素治疗后即可见肿瘤内PCNA阳性细胞密度下降，核PCNA阳性强度减弱，随浓度增加阳性率呈下降趋势。实验Ⅱ～Ⅳ组PCNA指数较对照组有显著差异。而实验Ⅰ组与对照组PCNA蛋白表达比较无统计学意义。推测抑胶素抑制肿瘤增殖的机制可能是抑制PCNA合成与表达，从而也就抑制了DNA合成，由此阻止肿瘤细胞质和细胞核的复制，抑制细胞有丝分裂。

　　本研究明确了抑胶素对脑胶质瘤细胞的抑制、杀伤作用，并且其作用机制之一可能与抑制PCNA合成与表达而阻止肿瘤细胞和细胞核的复制有关。上述实验结果，为今后进一步深入研究抑胶素及开发应用提供了实验依据。

参考文献

　　1 崔 俐，林卫红，姜慧轶，等.抑胶素对大鼠胶质瘤的抑瘤效应及对神经细胞黏附分子的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2005;22(2)：12830.

　　2 谢晓娜，马涤辉，林卫红，等.抑胶素对C6胶质瘤细胞P16蛋白表达的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2005;22(5)：302.

　　3 Ullrich N，Sontheimer H.Biophysical and pharmacologycal characterization of chloride currents in human astrocytoma cells〔J〕.Am J Physiol，1996;270:C151121.

　　4 Soroceanu L，Gillespie GY，Khazaeli MB，et al.Use of chlorotoxin for targeting of primary brain tumors〔J〕.Cancer Res，1998;58：48719.

　　5 Ullrich N，Sontheimer H.Expression of voltageactivated chloride currents in acute slices of human gliomas〔J〕.Neuroscience，1998;83(4):13613.

　　6 Korkolopoulou P，Christodoulou P，Lekka Katsouli I，et al.Prognosis significance of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) expression in gliomas〔J〕.Histopathology，1994;25:249355.