MCI186减轻Aβ140诱导PC12细胞tau蛋白磷酸化的研究

【摘要】 目的 探讨依达拉奉(MCI186)对β样淀粉蛋白(Aβ140)引起的PC12细胞tau蛋白磷酸化的保护作用及其机制。方法 采用 Western 印迹等检测Ser396，Ser199/202，Tau5及GSK3β，GSK3βSer9磷酸化水平，观察MCI186对Aβ2535致PC12细胞的损伤保护作用。结果 模型组 tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平及总tau蛋白水平在Aβ140作用3 h后开始升高，同时GSK3β的表达增多，磷酸化GSK3βSer9的表达减少，MCI186保护组tau蛋白在Ser396，Ser199/202位点的磷酸化水平和总tau蛋白水平均明显低于Aβ模型组(P<0.05)，GSK3β的表达减少，磷酸化GSK3βSer9的表达增多(P<0.05)。结论 在Aβ140诱导PC12细胞损伤过程中，出现了tau蛋白的过度磷酸化，可以使Ser396，Ser199/202位点及Tau5蛋白升高。激活GSK3β是产生tau蛋白过度磷酸化的主要途径。MCI186可通过抑制GSK3β的活性，从而减轻Aβ140诱导的tau蛋白过度磷酸化，而达到保护神经细胞的目的。

【关键词】 依达拉奉;阿尔茨海默病;糖原合成酶激酶3;tau蛋白磷酸化

AD是常见的中枢神经系统退行性疾病，在众多的发病机制中，更多的学者倾向于其核心改变是tau蛋白过度磷酸化。目前临床上用来治疗AD的药物均只能改善轻中度患者的部分症状，不能减轻脑内的病理改变，阻止病情的进展，对tau蛋白的过度磷酸化没有逆转作用。依达拉奉(MCI186)是一种自由基清除剂，可以特异性清除羟自由基(OH)，抑制氧化应激及其继发的细胞凋亡，发挥神经保护作用，主要应用于脑梗死的早期和脑出血的治疗。临床发现依达拉奉对部分痴呆患者有改善症状的作用，从而提示其可能是一种具有前途的治疗AD的药物。本研究旨在探讨依达拉奉对tau蛋白过度磷酸化是否有逆转作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂 PC12细胞购自中国生命科学院上海细胞所，Aβ140、兔抗鼠IgG购自北京鼎国生物公司，Tau〔PS396〕多克隆抗体、Tau〔PS199/202〕多克隆抗体购自Biosource公司，Tau5单克隆抗体购自BD Pharmingen公司，Protein Marker购自美国Biolabs公司，DAB显色试剂盒购自博士德公司，依达拉奉购自江苏先声药业有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养和预处理 用含有15%胎牛血清的DMEM培养基(3.7 g NaHCO3)，置于37℃，5% CO2孵箱中培养，每3天传代1次，传代时用机械方法吹打贴壁的PC12细胞，取生长期细胞用于实验。

　　1.2.2 实验分组

　　1.2.2.1 Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白磷酸化 将30 μmol/L Aβ140作用于PC12细胞，分别作用0，3，6，12，24，36 h后提取蛋白检测Tau〔PS396〕、Tau〔PS199/202〕及Tau5磷酸化水平。

　　1.2.2.2 LiCl对Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白磷酸化的影响 实验分为3组：(1)对照组：正常PC12细胞;(2)模型组：加入浓度为30 μmol/L Aβ140作用于PC12细胞12 h;(3)LiCl处理组：加入浓度为10 mmol/L LiCl与30 μmol/L Aβ140共同作用于PC12细胞12 h;检测Tau〔PS396〕，Tau〔PS199/202〕，Tau5及GSK3β，GSK3βSer9磷酸化水平。

　　1.2.2.3 MCI186对Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白过度磷酸化的影响 分3组：(1)对照组：不加任何处理因素;(2)模型组：加入浓度为30 μmol/L Aβ2535作用于PC12细胞12 h;(3)保护组：将20 μmol/L MCI186处理PC12细胞2 h后与30 μmol/L Aβ140共同作用于PC12细胞12 h;分别检测Tau〔PS396〕、Tau〔PS199/202〕、tau5及GSK3β，GSK3βser9磷酸化水平。

　　1.2.3 蛋白免疫印迹法(Western印迹法) 常规蛋白质提取; 采用Bradford(1976)法进行蛋白质定量。一抗为Tau〔PS396〕多克隆抗体、Tau〔PS199/202〕多克隆抗体、Tau5单克隆抗体、GSK3β、GSK3βser9抗体，二抗为兔抗鼠IgG。

　　1.3 统计学分析 所有数据均采用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件完成，并用EXCEL软件制图。

　　2 结 果

　　2.1 Aβ140诱导PC12细胞tau蛋白磷酸化水平的变化 tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平在Aβ140作用3 h后开始升高，达高峰12 h后逐渐降低;Tau5是磷酸化非依赖性抗体，反映细胞中tau蛋白的总量，其变化趋势与tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化增高相一致，提示Aβ2535在诱导PC12细胞致tau蛋白磷酸化增高的同时，也增加tau蛋白总量，见图1。

　　2.2 Aβ140诱导PC12细胞tau蛋白过度磷酸化分子机制

　　2.2.1 LiCl对Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白磷酸化的影响 凝聚态Aβ140作用于PC12细胞12 h后，Tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平增高;Tau5蛋白的表达也相应增高，提示凝聚态Aβ140可诱导PC12细胞tau蛋白过度磷酸化。LiCl处理组tau蛋白在上述位点的磷酸化水平与单纯Aβ处理组相比明显下降，总tau蛋白的表达也减少，提示LiCl可抑制Aβ所诱导的tau蛋白过度磷酸化，见图2。

　　2.2.2 LiCl及Aβ140对PC12细胞中GSK3β及磷酸化GSK3βSer9的影响 Aβ140作用于PC12细胞12 h后，细胞内GSK3β明显高于对照组，GSK3βSer9则低于对照组。可见Aβ140在诱导PC12细胞神经元tau蛋白过度磷酸化的同时GSK3β的表达增多，而磷酸化GSK3βSer9的表达减少，说明Aβ140可通过激活GSK3β而使tau蛋白磷酸化增多。而LiCl处理组磷酸化GSK3βSer9的表达明显高于模型组和对照组;GSK3β的表达则低于模型组。结果提示LiCl可通过抑制的GSK3β活性而使tau蛋白磷酸化减少，见图3。

　　2.3 MCI186对Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白过度磷酸化的影响

　　2.3.1 MCI186对Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白磷酸化的影响 用20 μmol/L MCI186处理后，tau蛋白在Tau〔PS396〕，Tau〔PS199/202〕位点的磷酸化水平和总tau蛋白比模型组减少，见图4。

　　2.3.2 MCI186对GSK3β总量及磷酸化GSK3βSer9的影响 MCI186减少了GSK3β总量的表达，而增加了GSK3βSer9的表达，说明MCI186对tau蛋白磷酸化的作用机制主要是通过激活GSK3β，抑制其生物活性实现的，见图5。

　　3 讨 论

　　AD是老年人最常见的神经变性疾病。其主要的分子生化改变为细胞外间隙大量的Aβ沉积和神经元胞体内tau蛋白的过度磷酸化，两者在病理形态学上分别表现为老年斑和神经原纤维缠结。尽管不少研究对tau蛋白与Aβ沉积的相互作用进行了探索，然而至今尚无一个得到公认的定论。

　　Aβ沉积和tau蛋白磷酸化之间有密切的联系。Igbal等〔1〕在1986年首次报道异常磷酸化的蛋白是患者脑神经元中双螺旋细丝，Aβ可直接引起tau蛋白过度磷酸化与NFTs的形成，最终导致神经元退行性改变。吴琪等〔2〕在大鼠海马内注射线丝状Aβ，观察神经元Ser202位点磷酸化的tau蛋白表达的变化，发现Aβ42具有诱导tau蛋白过度磷酸化的效应。体外研究也证实凝聚态的Aβ140、Aβ142或其活性片段Aβ2535能使原代培养的海马神经元、小脑颗粒神经元、畸胎瘤AD杂交细胞株NT2及PC12细胞发生退行性改变，同时导致tau蛋白在特定位点的磷酸化增多〔3～5〕。因此，用Aβ的生物活性片段Aβ140诱导建立tau蛋白过度磷酸化的细胞模型具有理论和实验依据。

　　Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布于神经元轴突和胞浆内，具有促进管蛋白聚集成微管和维持微管结构的功能。目前发现，Tau蛋白至少存在近30个Ser或Thr磷酸化位点〔6〕。已有研究通过对脑组织中不同种类的tau蛋白磷酸化状态进行比较，结果发现胎脑中Ser202、Ser396和Ser404位点有磷酸化形成，在成年人脑中除Ser404位点外，其余两位点不再有磷酸化形成;而AD患者脑中，Ser202、Ser396、Ser404以及Thr181、Thr23、Ser235、Ser262等位点上均可发生磷酸化。在PC12细胞中，可出现部分上述位点的磷酸化〔7～9〕。所以，本实验选用Ser396、Ser202位点研究tau蛋白磷酸化情况。本研究发现该浓度的Aβ140可使PC12细胞中tau蛋白的特定位点(Ser396、Ser199/202)的磷酸化水平增高，且tau蛋白过度磷酸化与Aβ140作用持续的时间有关，并具有一定程度的可逆性。Aβ2535作用3 h，Tau蛋白磷酸化水平开始升高，12 h达高峰，以后逐渐下降。总tau蛋白的变化趋势与tau蛋白磷酸化的改变大体一致，可能与tau蛋白磷酸化后其降解减少有关，但也有可能与tau蛋白功能异常后，细胞代偿合成增加有关。因此，本文选用12 h这一tau蛋白磷酸化达高峰的时间点，探讨Aβ140引起tau蛋白过度磷酸化的可能机制及MCI186的影响。

　　tau蛋白磷酸化的状态取决于蛋白激酶(催化磷酸化反应)和蛋白磷酸酯酶(催化去磷酸化反应)的相对活性。在蛋白激酶中，GSK3β最引人注目，在脑内表达丰富，尤其是大脑灰质。在细胞内，GSK3β主要位于胞浆，在胞核和线粒体中也有少量存在，当撤血清、抑制PI3K通路、Aβ、神经酞胺、线粒体毒素诱导皮层神经元、小脑颗粒神经元和PCl2细胞凋亡时，细胞核内的GSK3β明显升高〔10，11〕。有研究表明，GSK3β可能参与AD胆碱系统失调过程，最终导致乙酰胆碱合成下降。GSK3β能使tau蛋白Ser396、Ser199、Thr231、Ser396、Ser413等位点发生磷酸化〔10，12，13〕。GSK3β的活性受丝氨酸和酪氨酸磷酸化的调节，丝氨酸Ser9位点的磷酸化则下调GSK3β的活性。所以，本研究用GSK3β总量及活化型GSK3βSer9的表达水平反映GSK3β的活性变化，探讨Aβ140是否通过激活GSK3β来诱导tau蛋白的过度磷酸化。本文发现，用Aβ140作用于PC12细胞12 h，在引起tau蛋白磷酸化达到最高峰的同时，GSK3β的总量增加，而其活性形式磷酸化GSK3βSer9的表达则减少，提示凝聚肽Aβ140可使PC12细胞中GSK3β的活性增强，从而引起tau蛋白的过度磷酸化;用GSK3β的特异性抑制剂LiCl预处理后，Tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平均降低，GSK3β的活性形式磷酸化GSK3βSer9的表达也明显增多，提示抑制GSK3β活性，可减轻Aβ140引起的tau蛋白过度磷酸化。因此，激活GSK3β可能是Aβ140诱导tau蛋白过度磷酸化的主要机制。

　　近年来，MCI186在脑保护中应用较多，多用于脑梗死与脑出血的早期治疗，主要机制是清除自由基剂，抑制氧化应激及其继发的细胞凋亡，而tau蛋白过度磷酸化的本质也是氧化应激反应。本实验观察到利用MCI186处理后，Tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平较模型组明显降低，Tau蛋白的总量也比模型组降低。由此可见，MCI186可减轻Aβ2535诱导的tau蛋白过度磷酸化。为了探讨其机制，本研究进一步检测了MCI186预处理后PC12细胞中GSK3β及其活性形式磷酸化GSK3βSer9的表达，结果显示MCI186可影响GSK3β的表达，可见MCI186可通过抑制GSK3β的活性，从而减轻Aβ诱导的PC12细胞tau蛋白的过度磷酸化。

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