炎性衰老机制与干预的实验研究

　　　　 作者：夏世金 沈自尹　俞卓伟 李亚明 汪海东 黄建华

【摘要】 目的 运用基因芯片筛选与炎性衰老相关的炎性细胞因子与受体特征基因，探讨其炎性细胞因子网络调控机制;观察淫羊藿总黄酮(EF)和淫羊藿苷(Ica)对该网络的干预效果与机制。方法 SD大鼠分为4月龄(4 m)、24 m、24 m+EF和24 m+Ica组，每组10只。分别取各组大鼠海马和肺组织，用炎症细胞因子与受体基因芯片对各组组织分别进行基因表达检测。结果 (1)海马组织：24 m组与4 m组比较，促炎症细胞因子表达上调;同时抗炎症细胞因子下调。24 m+EF组、24 m+Ica组与24 m组比较，可见大量抗炎症细胞因子上调而促炎症细胞因子下调。(2)肺组织：24 m组与4 m组比较，促炎症细胞因子上调，同时抗炎症细胞因子下调。24 m+EF组、24 m+Ica组与24 m组比较，发现大量抗炎症细胞因子上调而促炎症细胞因子下调。结论 老年大鼠存在促炎性细胞因子基因表达上调和抗炎性因子表达下调，导致促抗炎性细胞因子网络平衡失调;EF和Ica可能通过下调促炎性细胞因子基因表达和上调抗炎性细胞因子基因表达，重塑促抗炎性细胞因子网络平衡而干预炎性衰老。

【关键词】 炎性衰老;基因芯片;大鼠;炎症细胞因子与受体;淫羊藿总黄酮;淫羊藿苷

　　【Abstract】 Objective To study the mechanisms of inflammatory cytokines network regulation in the development of inflammaging rats and analyze the Epimedium total flavonoids(EF) and Icariin(Ica) intervention outcome. Methods Healthy male Sprague Dawley rats were pided into 4 months (4 m)， 24 m， EF+24 m (24 m rats treated with EF) and Ica+24 m groups (24 m rats treated with Ica)， each with 10 rats. The genes expressions of hippocampus and lung tissues from the rats in each group were analyzed by inflammatory cytokines and receptors cDNA microarray respectively. Results (1)In rat hippocampus tissues， compared with those in 4 m group， proinflammarory genes were upregulated and antiinflammatory genes were downregulated. After treated by EF or Ica， antiinflammatory genes were upregulated while proinflammarory gene were downregulated in 24 m group. (2)In rat lung tissues， compared with those in 4 m group， 24 m rats showed upregulation of proinflaming genes， while antiinflammatory genes were downregulated. Similar results were observed after intervention by EF and Ica. Conclusions Upregulation of proinflamatory cytokines or receptors together downregulation of antiinflamatory genes may eventually contribute to disequilibrium of the network of pro and antiinflammatory cytokines and receptors and high inflammatory state. EF and Ica may interfere in inflammaging through rebuilding the new equilibrium of the network of pro and antiinflammatory cytokines and receptors.

　　【Key words】 Inflammaging;cDNA microarray; Rat; Inflammatory cytokins and receptors; Epimedium total flavonoids; Icariin

　自然衰老进程中有一个显著特征是慢性、低度、微炎性反应状态随增龄进行性升高，Franceschi等〔1〕在2000年首次将这种现象命名为炎性衰老(inflammaging)，被视为机体衰老进程速率和寿命的一个决定因素〔2〕，与老年相关疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、动脉粥样硬化和心脏病等密切相关〔3〕。炎性衰老是衰老研究领域的一个新成员，炎性衰老的机制与干预策略正逐渐受到人们的关注〔4〕，但在我国还是空白。 本研究以炎症细胞因子网络为切入点，应用炎症细胞因子与受体基因芯片技术，以老年大鼠的海马和肺组织为对象，绘制基因表达谱，筛选炎性衰老相关基因，同时探讨淫羊藿总黄酮(EF)和淫羊藿苷(Ica)对其影响，对探讨炎性衰老的机制和干预策略具有重要的理论价值和潜在的应用前景。

　　1 材料与方法

　　1.1 芯片及主要仪器 大鼠Oligo GEArrayR○炎症细胞因子与受体基因芯片(Inflammatory Cytokines and Receptors Microarray)(112个基因，SuperArray，ORN011)，购自上海康成生物有限公司。扫描仪(GeneChip Scanner 1000);图像数据分析软件：GEArray Expression Analysis Suite Software。

　　1.2 主要药物 EF由第二军医大学天然药化研究所从辽宁产朝鲜淫羊藿中提取，纯度大于80%。Ica购于上海友思生物技术有限公司(纯度为98%)。

　　1.3 动物与分组 清洁级健康雄性SD大鼠，购于四川省医学科学院实验动物中心，设4月龄(4 m)、24月龄(24 m)、24月龄+EF(24 m+EF)和24月龄+Ica(24 m+Ica)组，每组10只。24 m+EF组予EF(按60 mg·kg-1·d-1，融于5 ml蒸馏水中)灌胃，24 m+Ica组予Ica(按5 mg·kg-1·d-1，融于2 ml蒸馏水中)灌胃，24 m组给予2 ml蒸馏水灌胃，均自21个月满开始连续90 d，余同常规喂养。

　　1.4 取材 各组大鼠3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，2%碘酒、75%酒精消毒，打开头颅和胸腔，迅速取出海马和肺组织，所取组织立即放入液氮中，后转入-70℃冰箱保存待测。

　　1.5 基因芯片实验 分别将每组10只大鼠组织样本总RNA等量混合后进行基因表达谱检测。组织块用Trizol氯仿异丙醇法提取组织总RNA，紫外分光光度计定量;用SuperScriptⅡ和双链cDNA合成试剂盒合成和纯化cDNA，用RneasyMini 试剂盒用于体外转录合成cRNA以及cRNA 的纯化及片段化。组织mRNA，分别用cy3、cy5逆转录荧光标记制作cDNA探针。每组取cRNA片段1.5 μg 混合，共15 μg 配制杂交液，99℃温浴5 min，12 000 r/ min 离心5 min，将GEAhyb杂交液(GEAhyb Hybridization Solution，SuperArray Bioscience)注入装有Oligo GEArrayR○芯片杂交管中，10 r/ min 60℃预杂交芯片60～120 min，45 ℃，60 r/ min 杂交芯片16 h 。取出芯片，去除杂交液，加入300 μl 漂洗缓冲液直至芯片舱充满，应用Fluidics Station 450系统对芯片进行洗脱和染色。芯片图像可通过X胶片和GeneChip Scanner 1000 扫描仪获得，获取基因表达的荧光信号强度值，用内参照基因(管家基因)原始获取信号进行均衡和修正。使用GEArray表达分析配套软件进行完整的芯片数据分析。计算荧光信号的强度和比值。基因差异表达相差2倍以上，即表达上调〔信号比的对数值(Signal Log Ratio，SLR)>2〕，表达下调(SLR<2)为有统计学意义。基因检测在上海康成生物有限公司完成。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠海马组织炎症细胞因子与受体基因差异表达

　　2.1.1 24 m组海马组织中表达上调或下调的炎症细胞因子及受体基因 与4 m组比较，24 m组中表达上调的促炎性反应细胞因子与受体基因9个，即白介素(IL12β、1β、2、6、8rβ)、肿瘤坏死因子(TNF、TNFSF11)、趋化因子(CCL2、CX3CL1)。表达下调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL10rα、13、4r、9r，转化生长因子(TGFα、β1)共6个。

　　2.1.2 24 m+EF组海马组织中表达上调或下调的炎症细胞因子与受体基因 与24 m组比较，24 m+EF组中表达上调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL10、10rα、13、9r，TGFα、β1、β2、

　　βR2共8个;下调的促炎细胞因子与受体基因有：IL15、18、1β、2、6、6r、8rβ，TNF，CCL2、CCL3、CX3CL1共11个。

　　2.1.3 24 m+Ica组海马组织中表达上调或下调的炎症细胞因子与受体基因 与24 m组比较，24 m+Ica组中表达上调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL10、13、4r、9r，TGFβ1、β2共6个;下调的促炎细胞因子与受体基因有： IL15、1β、2、6、8rβ，TNF，CCL2、CCL3、CX3CL1共9个。

　　2.2 大鼠肺组织炎症细胞因子与受体基因差异表达

　　2.2.1 24 m组肺组织中表达上调或下调的炎症细胞因子及受体基因 与4 m组比较，24 m组中表达上调的促炎性反应细胞因子与受体基因14个，即白介素(IL12α、12β、15、18、1α、1β、2、3、6)、肿瘤坏死因子(TNF、TNFSF11)、趋化因子(CCL2、CCL3、CX3CL1)。表达下调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL10rα、13、4r、9r，TGFα、β1共6个。

　　2.2.2 24 m+EF组肺组织中表达上调或下调的炎症细胞因子与受体基因 与24 m组比较，24 m+EF组中表达上调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL10、10rα、13、4r、9r，TGFα、β1共7个。下调的促炎细胞因子与受体基因有： IL12β、1β、2、6、6r，TNF、TNFSF4、CCL2、CCL3、CX3CL1共10个。

　　2.2.3 24 m+Ica组肺组织中表达上调或下调的炎症细胞因子与受体基因 与24 m组比较，24 m+Ica组中表达上调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL10、13、4r、9r，TGFβ1共5个。下调的促炎细胞因子与受体基因有： IL1β、2、6、8rβ，TNF、CCL2、CCL3、CX3CL1共8个。

　　2.3 大鼠不同组织以及EF和Ica干预后炎性细胞因子表达模式的比较 通过比较，发现海马和肺组织检测结果高度一致。与4 m青年大鼠相比，24 m老年大鼠海马和肺组织中出现促炎细胞因子与受体基因表达上调，上调的基因在两个组织类似，包括IL、TNF、CCL等(见表1);同时下调的抗炎细胞因子在两个组织也类似;提示有相同的机制参与了不同组织的炎性衰老过程。EF和Ica干预后，海马和肺组织出现促炎细胞因子和受体基因表达下调，部分基因恰为24 m组上调的基因(见表1);抗炎细胞因子和受体基因表达上调，部分恰为24 m组下调的基因。通过比较EF和Ica干预后炎症细胞因子的表达变化，发现两者干预的基因谱有相当程度的重叠，这提示Ica在干预炎性衰老方面可以代表EF的效果，其分子机制可能相同。表1 各组间炎症细胞因子与受体基因差异表达的变化

　　海马肺24 m组上调的促炎基因(与4 m组比较)IL12β、1β、2、6、8rβ TNF、TNFSF11 CCL2、CX3CL1IL12α、12β、15、18、1α、1β、2、3、6、TNF、TNFSF11、CCL2、CCL3、CX3CL124 m+EF组下调的促炎基因(与24 m组比较)IL1β、2、6、6r、8rβ、15、18 TNF、CCL2、CCL3、CX3CL1 IL1β、2、6、6r、12β、TNF、TNFSF4、CCL2、CCL3、CX3CL124 m+Ica组下调的促炎基因(与24 m组比较)IL1β、2、6、8rβ、15、TNF、CCL2、CCL3、CX3CL1IL1β、2、6、8rβ、TNF、CCL2、CCL3、CX3CL1

　　3 讨 论

　　1974年Cohen和Bigazzi提出了细胞因子的概念〔5〕。炎性细胞因子是由神经、免疫、内分泌以及组织细胞分泌的具有高度生物活性的可溶性蛋白或糖蛋白。炎性细胞因子包括IL、干扰素、TNF、集落刺激因子和TGF等。他们能通过受体介导，以旁分泌和(或)自分泌的方式参与机体内复杂的细胞细胞调节网络，在某些情况下也可进入循环并引起全身效应。许多炎性细胞因子交互作用构成了炎性细胞因子网络，这个网络可分为两个子网络：促炎性细胞因子网络和抗炎性细胞因子网络。促炎性细胞因子网络主要成员有TNFα、干扰素γ、某些IL(IL1、6、8)等;抗炎性细胞因子网络中主要有TGFβ1、IL4、10、13等。炎症如同免疫反应一样是机体的正常生理功能，适度的炎症反应对机体有利，反之则有害。炎性细胞因子网络的变化控制着炎症发生发展的方向。促炎症细胞因子网络和抗炎症细胞因子网络的动态平衡共同维持机体的促炎与抗炎反应体系平衡，维持炎症的正常生理功能，这种平衡一旦被打破就会引起病理性炎症变化〔6～8〕。本研究以炎性细胞因子网络为切入点，探讨炎性衰老机制和干预策略。结果表明，与青年大鼠相比，老年大鼠海马和肺促炎性反应细胞因子与受体基因表达上调，可能是促炎性细胞因子网络和抗炎性细胞因子网络失去平衡的关键原因之一，进而导致促炎性反应状态升高，促抗炎性反应体系失衡。

　　从健康老年人实验可知，衰老与高促炎症反应状态相关。高促炎症反应状态的原因是循环中促炎症细胞因子介质，包括IL1、6、TNFα和PGE2水平的升高〔9，10〕，使得老年人的组织器官不断地处于这种炎性环境之中。这些结果是从单基因角度研究得出的。然而，本研究运用基因芯片检测技术探讨炎性衰老的炎症细胞因子网络机制。高通量基因表达谱芯片的应用，使得人们对生物的研究可以从以往对单个基因的局部、片面性研究，上升到对整个基因组在各种条件下系统性、定量的研究层面，从全局角度分析复杂系统的生物信息数据挖掘技术、疾病相关基因发现、基因功能预测、研究基因表达调控、代谢通路和信号传导等〔11〕。所以基因表达谱为我们能够在转录组水平上全面、系统的研究衰老进程中基因的时空变化特征和分布规律提供了可行的技术手段。

　　研究表明，炎性细胞因子在海马和肺组织中高表达，并对机体衰老的进程产生重要影响。海马通过调节下丘脑垂体肾上腺(HPA)轴功能参与调控应激和机体衰老进程〔12，13〕。肺组织随着增龄而呈退行性变化，这种退行性变化在人体的衰老过程中发生较早，可能因为它直接与外界环境接触，易受伤害性因素(如污染、感染、吸烟等)的影响，这些损伤因素包括了体内形成的细胞因子和氧自由基。并且肺接受来自全身的循环血液，最容易受到各种有害因素的攻击，是机体最先衰老的器官之一〔14，15〕。因此，本实验选择海马和肺组织作为观察对象。

　　淫羊藿，又名仙灵脾，李时珍在《本草纲目》中称其有“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”之功效。现代药理实验研究表明，淫羊藿能增加心脑血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具抗衰老，抗肿瘤等功效。EF是从小蘖科淫羊藿属植物的茎叶中提取的总黄酮类成分。研究证实EF具有干预衰老的功效〔16，17〕。Ica是EF中的一种主要活性成分，分子式为C33H40O15，结构上属于8异戊烯基黄酮醇苷类化合物。现代药理学研究表明，Ica具有免疫调节、抗肿瘤、调节内分泌和心血管系统等多种重要的生物活性，是很有应用前景的中药单体。本研究结果表明，与青年大鼠相比，老年大鼠海马和肺上调的促炎性细胞因子基因有IL、TNF和CCL，而EF和Ica下调的促炎性细胞因子基因及其数量几乎都是老年大鼠上调的那部分促炎性细胞因子基因。表明EF和Ica可能通过下调内源性促炎性细胞因子基因表达，同时上调内源性抗炎性细胞因子基因表达，重塑促抗炎性细胞因子网络和促抗炎性反应体系新的平衡，达到干预炎性衰老的目的。自然炎性衰老进程中的一个显著特征是机体内存在着增龄性、慢性、低度、微炎症反应状态，因此所要求的干预药物必须具备有效、安全、可长期使用、无毒副作用等特点，EF和Ica恰好具备这些特点，因此EF和Ica可能是干预炎性衰老理想的候选药物，值得深入研究。此外，EF和Ica在本实验中表现出相似作用，EF和Ica组相比，EF作用的靶基因更多，这可能是因为Ica仅仅是EF中的一个成分所致。至于EF与Ica干预炎性衰老的异同与优劣还有待进一步探讨。

参考文献

　　1 Franceschi C，Bonafè M，Valensin S，et al.Inflammaging.An evolutionary perspective on immunosenescence〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2000;908:24454.

　　2 Martinis DM，Franceschi C，Monti D，et al.Inflammageing and lifelong antigenic load as major determinants of ageing rate and longevity〔J〕. FEBS Lett，2005;10:20359.

　　3 Franceschi C，Valensin S，Lescai F，et al.Neuroinflammation and the genetics of Alzheimer′s disease：the search for a proinflammatory phenotype〔J〕.Aging(Milano)，2001;3:163170.

　　4 夏世金，沈自尹，刘小雨，等.炎性衰老的研究进展〔J〕.中华老年医学杂志，2007;26(7):5503.

　　5 Cohen S，Bigazzi PE，Yoshida T.Commentary similarities of T cell function in cellmediated immunity and antibody production〔J〕.Cell Immunol，1974;12(1):150.

　　6 Gasz B，Lenard L，Racz B，et al.Effect of cardiopulmonary bypass on cytokine network and myocardial cytokine production〔J〕.Clin Cardiol，2006;29(7):3115.

　　7 Kenneth M，Kulmatycki，Jamali F.Drug disease interactions:role of inflammatory mediator in in disease and variability in drug response〔J〕.J Pharm Pharmaceut Sci，2005;8(3):60225.

　　8 Wichers MC，Kenis G，Koek GH，et al.Interferonalphainduced depressive symptoms are related to changes in the cytokine network but not to cortisol〔J〕.J Psychosom Res，2007;62(2):20714.

　　9 Bruunsgaard H，AndersenRanberg K，Hjelmborg JB，et al.Elevated levels of tumor necrosis factor alpha and mortality in centenarians〔J〕.Am J Med，2003;115:27883.

　　10 Cesari M，Penninx BW，Pahor M，et al.Inflammatory markers and physical performance in older persons：the InCHIANTI study〔J〕.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2004;59:2428.

　　11 Scherf U.A Gene expression database for the molecular pharmacology of cancer〔J〕.Nature Genetics，2000;24:23644.

　　12 Mobbs CV.Neurendocrinology of aging.In：Schneider EL，Rowe JW，editors.Handbook of the biology of aging〔M〕.San Diego(CA):Academic Press，1996：23482.

　　13 Reul JM，Rothuizen J，de Kloet ER.Agerelated changes in the dog hypothalamicpituitaryadrenocortical system：neuroendocrine activity and corticosteroid receptors〔J〕.J Steroid Biochem Mol Biol，1991;40(13):639.

　　14 Tuder R.Aging and cigarette smoke：fueling the fire〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2006;174:4901.

　　15 Sato T，Seyama K，Sato Y，et al.Senescence marker protein30 protects mice lungs from oxidative stress，aging，and smoking〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2006;174:5307.

　　16 沈自尹，陈 瑜，黄建华，等.EF延缓HPAT轴衰老的基因表达谱研究〔J〕.中国免疫学杂志，2004;1:5962.

　　17 夏世金，沈自尹，刘小雨，等.核因子κB调控老年大鼠脾淋巴细胞凋亡及淫羊藿总黄酮对其影响〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(2):1058.