皂角皂苷对SMMC7721细胞Caspase3表达的影响

【摘要】 目的 探讨皂角皂苷对应用阿霉素后SMMC7721细胞Caspase3表达的影响。方法 MTT法检测单独应用阿霉素(DOX)或阿霉素与皂角皂苷联合作用的SMMC7721细胞的生存率;RTPCR检测Caspase3 mRNA表达。结果 与对照组相比，单独应用阿霉素组细胞的生存率未见明显变化;而阿霉素与皂角皂苷联合作用组细胞存活率显著降低，Caspase3 mRNA表达增高。结论 皂角皂苷可能通过上调Caspase3水平进而诱导SMMC7721细胞的凋亡，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

【关键词】 SMMC7721细胞;凋亡;Caspase3;皂角皂苷

细胞凋亡的机制中，凋亡的细胞因子受体信号转导途径一直被人们所关注，尤其是细胞内蛋白水解酶(cysteinyl aspartatespecific proteases，Caspase)〔1〕。Caspase是目前公认的细胞凋亡后期的共同途径。本实验以SMMC7721细胞株为研究对象，利用特殊工艺从皂角皂苷中提取有效部位，通过检测细胞的生存率及Caspase3的表达，探讨皂角皂苷对SMMC7721细胞的诱导凋亡作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 SMMC7721细胞株细胞由吉林大学第一医院提供。阿霉素、DAB购于Sigma，皂角皂苷由长春中医学院赠予，IMDM培养基和新生牛血清购于Hyclone，Trizol试剂购于Invitrogen，Caspase3引物和PCR试剂购于Takara。

　　1.2 SMMC7721细胞培养 SMMC7721细胞置于完全培养基(10% Hyclone新生牛血清，IMDM培养液pH7.4)中，37℃，5% CO2培养箱中培养。细胞在无阿霉素的条件下培养1 w后用于实验。细胞传代的浓度为5×105/ml。

　　1.3 亚甲基四唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)测定细胞生存率 取对数生长期的SMMC7721细胞。消化、离心，使成单细胞悬液，计数，以细胞数1.0×104/孔接种于96孔板中。24 h后，加入不同浓度的药物，单独应用阿霉素5 μg/ml及阿霉素5 μg/ml分别与皂角皂苷50、100 μg/ml联合应用。24 h后，每孔加入0.5 mg/ml的MTT液20 μl，4 h后弃掉培养液，每孔加150 μl DMSO，570 nm测其吸光度值。实验重复5次。

　　1.4 SMMC7721细胞Caspase3 mRNA的表达 同剂量药物作用24 h，SMMC7721细胞中总RNA提取参照UltraspecTMII RNA Isolation System(Biotecx Laboratories，INC)说明书进行，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。GAPDH引物序列为正义: 5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′，反义:5′AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC3′，片段大小700 bp。Caspase3引物序列为正义: 5′TTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCC3′， 反义: 5′ATTCTGTTGCCACCTTTCGG3′，片段大小400 bp。PCR反应条件：变性94℃，30 s，退火59℃，30 s，延伸72℃，45 s。Caspase3为28个循环，GAPDH为25个循环。取PCR产物进行电泳，凝胶成像系统下观察并拍照。实验重复3次。

　　1.5 统计学处理 数据均以x±s表示，用SPSS11.0软件进行多组间ANOVA分析。

　　2 结 果

　　2.1 阿霉素和皂角皂苷对SMMC7721细胞生存率的影响 阿霉素(5 μg/ml)单独作用于SMMC7721细胞时，细胞存活率(80%)与对照组(90%)比较无明显变化。皂角皂苷(50、100 μg/ml)单独作用于SMMC7721细胞时，细胞存活率也无明显变化。当阿霉素和皂角皂苷联合作用于SMMC7721细胞时，阿霉素5 μg/ml+皂角皂苷50 μg/ml组(52%)、阿霉素5 μg/ml+皂角皂苷100 μg/ml组(42%)与对照组或阿霉素组比较，细胞存活率明显下降(P<0.01)。

　　2.2 阿霉素和不同浓度皂角皂苷作用SMMC7721细胞Caspase3 mRNA表达 RTPCR结果表明：阿霉素单独作用SMMC7721细胞时，与对照组相比Caspase3 mRNA表达未见明显差异;阿霉素和不同浓度皂角皂苷共同作用时，与对照组和阿霉素单独作用时相比Caspase3 mRNA表达明显增高(图1)。

　　1.对照组; 2.阿霉素5 μg/ml; 3.阿霉素5 μg/ml+ 皂角皂苷 50 μg/ml; 4.阿霉素5 μg/ml+皂角皂苷100 μg/ml

　　图1 阿霉素和不同浓度皂角皂苷作用下

　　SMMC7721 细胞Bcl2 mRNA表达

　　3 讨 论

　　原发性肝癌具有恶性程度高、发展快、生存期短等特点，本实验选用由人原发性肝癌建立起来的细胞株SMMC7721为体外研究对象，探讨皂角皂苷的抗肿瘤作用。肿瘤细胞增殖与凋亡的失衡是影响肿瘤发生和发展的重要因素。Caspase3是介导细胞凋亡的一类蛋白水解酶，即Caspase中的关键效应酶，是凋亡执行的核心效应分子〔1〕。Caspases 为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶，是一组具有相似氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶，它除参与细胞因子成熟、细胞生长和分化外，还与细胞凋亡密切相关。Caspases 级联反应在凋亡通路中处于重要地位，尤其是 Caspase3是其中心环节〔2〕。

　　Caspase3处于细胞凋亡的下游，细胞凋亡有细胞外和细胞内两条经典的途径。在细胞外途径中，死亡信号的传导靠死亡配体与受体的结合来展开，接着死亡受体的死亡结构域与信号传导分子结合，信号传导分子又与Caspase8酶原相连接，激活Caspase8使线粒体释放细胞色素C，或直接作用于Caspase3及其他下游的Caspase。在细胞内途径中，细胞内的死亡信号，例如DNA损伤、毒素和ATP耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素C，激活Caspase3降解底物使细胞凋亡〔3～6〕。

　　实验结果显示：阿霉素5 μg/ml单独作用SMMC7721细胞时，与对照组相比Bcl2表达未见明显差异; 阿霉素和不同浓度皂角皂苷共同作用时，Caspase3 表达增高，并呈剂量依赖性。表明皂角皂苷使Caspase3的表达增高，从而诱导SMMC7721细胞的凋亡，提高化疗药物敏感度。结合以上实验结果，我们认为皂角皂苷对SMMC7721细胞的促凋亡作用可能是通过其直接或间接地使Caspase3的表达增高，进而提高化疗药物的敏感度，达到诱导细胞凋亡的作用。

　　总之，皂角皂苷与阿霉素合用促进了SMMC7721细胞株的凋亡，其机制可能与Caspase3介导的细胞凋亡有关。皂角皂苷能否在体内有抗肿瘤作用尚待进一步研究。

参考文献

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