依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响

　　　　　　 作者：于亚新 刘宝华 李海峰 刘晓亮

【摘要】 目的 观察脑神经保护剂依达拉奉对创伤性脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护作用，并探讨其作用机制。方法 采用大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型，通过凋亡原位TUNEL检测评价神经细胞凋亡情况，并采用免疫组化的方法检测各组不同时段大鼠脑组织caspase3的表达。结果 脑缺血再灌注后凋亡细胞在48 h达到高峰，治疗组和模型组比较在48、72 h差异有统计学意义(P<0.05)。caspase3在缺血再灌注12 h起显著增加，48 h达高峰期。治疗组与模型组比较，再灌注后48、72 h可明显降低 caspase3表达(P<0.05)。结论 脑缺血后 caspase3表达增高，自由基清除剂依达拉奉可以保护脑组织，其作用可能与抑制caspase3在损伤脑组织中的表达有关。

【关键词】 缺血再灌注损伤;caspase3;凋亡;依达拉奉

原发性脑损伤后继发的缺血再灌注损伤成为脑损伤不可逆的主要因素。目前依达拉奉(edaravone)是对脑缺血再灌注损伤中产生的自由基进行清除的有效药物，通过清除自由基及其引发的脂质过氧化抑制脑水肿和迟发性神经细胞死亡，从而有效改善神经缺损体征〔1〕。依达拉奉从根本上改变了脑损伤急性期的治疗策略和神经保护治疗措施。本文拟探讨依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 选用健康雄性清洁级 SD大鼠 160只，体重 200～280 g，鼠龄 3～4个月，由吉林大学基础医学院动物中心提供。

　　1.2 模型制备与分组 将入选的动物随机分成正常组、假手术组、模型组和治疗组，其中正常组、假手术组各5只大鼠，假手术组给予麻醉及切口暴露。模型组和治疗组又分为缺血 2 h再灌注6、12、24、48、72 h组，每小组各 5只大鼠。在22℃环境温度中实验，予3 %戊巴比妥钠 40 mg/kg腹腔注射麻醉，行颈正中切口，暴露双侧颈总动脉，麻醉减浅后，右侧上无创微动脉夹夹闭30 min，制作大鼠右侧大脑缺血再灌注模型。选用苏醒后行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为模型成功者进行实验。

　　1.3 实验药物与给药方法 实验药物依达拉奉 (必存注射液)由南京先声药业有限公司提供。给药方法为再灌注同时予尾静脉注射给药，之后每隔 12 h注射给药1次，直至动物被处死。给药剂量为 0.3 mg/100 g，浓度为 1.5 mg/ml。

　　1.4 取材及标本处理 在预定的时间麻醉，开胸，灌注固定，断头取脑。在视交叉后 1 mm及 4 mm处冠状切面切开鼠脑，取中间切块以观察，进行脱水，石蜡包埋。切片分别进行HE染色，细胞凋亡检测，caspase3免疫组化染色。

　　1.4.1 HE染色 切片常规脱蜡，水化苏木素染色5 min盐酸乙醇分色30 s，伊红复染1～2 min，水洗、脱水、透明、中性树胶封片。

　　1.4.2 神经细胞凋亡原位TUNEL检测 (1)石蜡包埋切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，l×TBS(20 mmol/L Tris，pH7.6;140 mmol/L NaCl)洗涤。(2)用10 mmol/LTrisCl(pH8.0)稀释蛋白酶K(终浓度为20 μg/ml)100 μl，覆盖整个样本，室温孵育20 min以灭活内源性过氧化物酶，l×TBS洗涤。(3)用甲醇1∶10稀释30%h3O2，每个样本用10 μl 30%h3O2与90 μl甲醇混合液室温孵育5 min，1×TBS洗涤。(4)加100 μl用蒸馏水1∶10稀释的10×TdT平衡缓冲液(0.5 mol/LTris，pH8.0;0.5 mol/L NaCl;0.1 mol/L MgCl2)，室温孵育20 min，吸去液体，加60 μl dUTP标记反应混合液(58.4 μl dUTP标记反应混合物;1.6 μl TdT酶)，37℃孵育1.5 h，l×TBS洗涤，加100 μl终止液(0.5 mol/L EDTA，pH8.0)，1×TBs冲洗，加100 μl封闭液(4%BSA/PBS)，室温孵育10 min，吸去液体。(5)加100 μl 链卵白素(streptavidin)标记的过氧化物酶溶液，室温孵育30 min，1×TBS洗涤。(6)加100 μl DAB显色液溶于1 ml 0.05 mol/L TBS pH7.6，室温孵育10 min，蒸馏水漂洗，苏木素衬染。梯度酒精常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。(7)阴性对照片用PBS代替TdT酶，其余步骤相同。

　　1.4.3 caspase3蛋白检测 (1)组织切片常规二甲苯脱腊、梯度酒精脱水。(2)蒸馏水新鲜配制3% h3O2，室温作用10 min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。(3)微波修复抗原:将切片浸入0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(柠檬酸钠12.05 g，柠檬酸1.891 g，加蒸馏水500 ml，pH6.0)中，微波炉加热至沸腾后10 min，冷却后用0.1 mol/L PBS洗涤2次。(4)甩干PBS液，加l抗37℃孵育60 min，0.1 mol/LPBS洗涤3次，每次3 min。(5)加2抗37℃孵育60 min，0.1 mol/LPBS洗涤3次，每次3 min。(6)滴加SABC，室温孵育30 min，0.1 mol/L PBS洗5 min×4次。(7)浸入新鲜配制的0.01%h3O2/0.04%DAB中，室温显色5～15 min，显微镜下控制染色强度，充分水洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。(8)阴性对照片用PBS代替一抗，其余步骤相同。

　　1.5 结果判定 普通显微镜下观察。胞核内有棕色着色者为凋亡细胞，胞浆呈棕色着染者为caspase3蛋白表达阳性细胞(用Olympus数码成像系统进行拍照)。取相邻脑片高倍镜(×400)下计数TUNEL阳性细胞和caspase3阳性表达细胞。

　　1.6 统计学分析 结果以x±s表示。组间差异用Student′s t检验进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 HE染色结果 模型组大鼠脑组织可见神经细胞染色淡，数量减少，少量细胞出现肿胀、胞核碎裂溶解等细胞坏死的特征，并可见少量中性粒细胞浸润。高倍镜下观察可见细胞核固缩，染色质浓染边聚。这种变化在模型组72 h尤为明显。假手术组可见在红细胞无出血灶，脑组织未出现上述变化。治疗组可见少量神经细胞坏死及中性粒细胞浸润。

　　2.2 神经细胞凋亡情况 凋亡细胞时点分布:脑缺血再灌注后6 h即有少数神经细胞凋亡，细胞核固缩被染成棕黄色大小几乎一致;24 h后凋亡神经细胞数目逐渐增多;缺血再灌注后48 h达到高峰，胞体缩小，核膜皱缩，染色质浓缩，浓集于核膜附近，核内出现棕黄色颗粒，核不规则固缩块状浓染呈棕褐色;48 h后呈下降趋势。假手术组在各个时间点脑组织切片见少量阳性细胞。与模型组比较，治疗组12、24 h阳性细胞明显降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，48、72 h差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1 各组再灌注不同时点凋亡细胞数与模型组比较： 1)P<0.05，下表同

　　2.3 caspase3蛋白表达 正常组及假手术组神经细胞胞浆中caspase3无明显表达。模型组在术后12 h可见caspase3在神经细胞胞浆中开始表达，24 h后表达增加，48 h达到高峰，显色最深。caspase3阳性神经细胞染色主要位于胞浆，胞浆呈棕黄色而细胞核呈蓝色，高倍镜下观察caspase3表达显色深的神经细胞形态较为正常，细胞核较完整。72 h caspase3蛋白表达逐渐减弱。治疗组再灌注后24 h与相同时间的模型组比较无显著性差异，再灌注后48、72 h与模型组比较均明显降低。治疗组神经细胞凋亡与caspase3表达的关系见表2、图1。表2 caspase3蛋白表达检测结果

　　3 讨 论

　　清除自由基和抑制脂质过氧化对脑缺血再灌注损伤具有重要作用。活性氧造成的过氧化损伤参与了人和动物的脑缺血发病机制。自由基清除剂对脑缺血后组织损伤及延迟的神经元死亡有保护作用，已成为脑梗死急性期的有效治疗手段之一〔2〕。依达拉奉对脑缺血具有强大的保护作用，是一种有效的脑神经保护剂〔3〕，其机制主要是消除自由基、抑制脂质过氧化和调控凋亡相关基因表达，抑制脑细胞(血管内皮细胞、神经细胞)的过氧化作用，从而减轻脑缺血及脑缺血引起的水肿和组织损伤〔3〕。

　　在缺血损伤过程中，神经细胞的死亡形式有两种，即坏死和凋亡。细胞凋亡是受基因调控的主动性细胞死亡，是缺血性损伤病理过程中的一个重要环节，它的发生对缺血损伤后的发展及结局意义显著。脑缺血后，脑血流量减少，ATP及氧供应减少，引起缺氧性去极化，离子通道功能障碍，氧自由基堆积，诱导一系列基因产物如即早基因、热休克蛋白、神经营养因子、Bcl2/Bax系统表达增加，引起线粒体功能障碍，最终激活caspases蛋白酶级联反应，引起细胞死亡。

　　caspase是细胞凋亡程序中一类关键的同源半胱氨酸蛋白酶，根据N端前域的长度，可将caspases家族成员分为两种类型:调控caspases即启动型;效应caspases即执行型。启动型caspases有较长的前域，接受死亡信号，启动凋亡，参与打靶和激活调控，包括caspase1、2、4、5、8、9、10、11、12、13;执行型含有较短的前域，作为凋亡的效应因子，在级联下游进行底物酶切，降解细胞骨架、蛋白质、核酸等，包括caspase3、6、7、14。其中caspase3作为caspase级联反应中最关键的效应酶，在凋亡执行过程中起重要作用。caspase3通常以无活性的酶原形式存在于细胞中，经两条不同的途径分别由caspase9或caspase8激活，最终引起细胞凋亡〔4〕。

　　本实验表明模型组caspase3蛋白免疫反应强度再灌注后明显升高，治疗组caspase3蛋白阳性表达也有增加，但再灌注后24 h与模型组比较无显著性差异，再灌注后48、72 h与模型组比较均显著性降低，说明凋亡的发生需要一定的时间。依达拉奉可能通过某种途径抑制caspase3蛋白表达从而抑制细胞凋亡，使大脑细胞避免发生迟发性神经元死亡。因此推测，依达拉奉可能减少缺血诱导的细胞色素C的释放，从而参与了减弱caspase3表达的过程，但是尚须进一步研究确定是否有其他途径参与。

参考文献

　　1 Jesmin I，Tomoaki I.Shortterm administration of a new free radical scavenger，edaravone，is more effective than its longterm administration for the treatment of neonatal hypoxicischemic encephalopathy〔J〕.Stroke，2005;36(11)：246874.

　　2 Miyamoto H，Takashi T.Edaravone attenuates brain edema and neurologic deficits in a rat model of acute intracerebral hemorrhage〔J〕. Stroke，2008;39(2)：4639.

　　3 龙 威，陆 刚，丁春梅.依达拉奉治疗老年急性脑梗死的疗效观察〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(2)：3645.

　　4 Kazuchika S，Teruhisa H.Experimental study on the protective effects of edaravone against ischemic spinal cord injury〔J〕.Thorac Cardiovasc Surg，2005;130：158692.