血管性痴呆大鼠PSD95变化机制的研究

【摘要】 目的 研究血管性痴呆(VD)大鼠形成过程中突触后致密物质95(PSD95)的变化规律及作用机制。方法 永久性结扎双侧颈总动脉制备VD大鼠模型，用Morris水迷宫衡量大鼠的学习记忆水平，用免疫组化法检测大鼠海马PSD95的表达。结果 随术后缺血时间延长，VD大鼠的学习记忆能力下降，术后4 w后与假手术组有显著差异(P<0.01);PSD95的表达随术后时间变化，呈先升后降改变，术后2 w时表达最多，与假手术组有显著差异(P<0.01)，此后逐渐减少，并明显低于假手术组(P<0.01)，术后16周时表达最少。结论 PSD95的表达变化与VD的发生发展有关，PSD95将成为治疗VD的新的靶点

【关键词】 血管性痴呆;PSD95;学习记忆

突触后致密物质95(postsynaptic density 95，PSD95)在学习记忆、突触可塑性等生理过程和缺血缺氧等病理损伤上具有独特的生物效应〔1～3〕，因而受到国外许多学者的重视，而国内相关研究很少〔4〕，尚未见到PSD95在血管性痴呆(VD)方面的研究报道。本实验通过双侧颈总动脉永久性结扎制备的VD大鼠模型，研究慢性缺血性痴呆的发生发展过程对PSD95表达的影响及由此产生的生物学意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 雄性Wistar大鼠128只(吉林大学医学动物中心提供)，体重280～300 g，随机分为假手术组(64只)和VD模型组(64只)，两组根据手术后时间长短，又分为术后1、3 d、1、2、4、8、12和16 w等8个亚组，每组8只大鼠。

　　1.2 VD动物模型制备 大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，保证手术期间有自主呼吸。仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结扎，中间离断，建立VD大鼠动物模型。假手术组大鼠除不结扎颈总动脉外，麻醉方法及手术过程均与模型组相同。

　　1.3 检测指标及方法

　　1.3.1 行为学检测 采用中国医学科学院生产的Morris水迷宫，以搜索持续时间(逃避潜伏期)和跨越平台次数作为衡量大鼠记忆功能的标准，检测大鼠术前及术后不同时间内水迷宫学习成绩。

　　1.3.2 脑组织病理标本制备 各组动物分别于相应的时间点深麻下开胸，先后分别用4℃生理盐水(200 ml/鼠)、4℃ 4%多聚甲醛(500 ml/鼠，PBS配制，pH7.4)经左心室冲洗和灌注固定，灌毕取脑，4℃后固定过夜。常规乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，连续切片，厚度为5 μm。

　　1.3.3 PSD95免疫组织化学染色 采用SP 染色法检测组织PSD95的表达，一抗为小鼠抗大鼠PSD95单克隆抗体(效价1∶300，Stressgen公司)，二抗羊抗小鼠IgG(福州迈新生物技术有限公司，效价1∶1 000)。用PBS代替一抗做阴性对照。按SP免疫组化染色试剂盒 (福州迈新生物技术有限公司)说明书操作，DAB 显色系统闭光显色后光镜观察，阳性表现为神经细胞胞浆及胞膜上呈棕黄色。

　　1.3.4 图像分析 在光学显微镜下观察每一组动物海马区，每只大鼠相同部位连续取10张片子，分别选择5个不重复视野进行观察，测出每高倍视野组织切片的阳性细胞数，所得数据计算其均值，再计算每组平均值。

　　1.4 统计学分析 所得计量资料数据用x±s表示，采用方差分析及t检验进行统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠行为学检测结果 所有大鼠在术前均行Morris水迷宫测试，确定各大鼠间无明显智能差异，符合标准。术后1 d及3 d的大鼠因其一般状态较差未行水迷宫测试，其余6个时间点均再次检测了水迷宫成绩，发现随缺血时间的延长，大鼠游迷宫时间逐渐增加，跨越平台次数逐渐减少，术后第4、8、12、16周组与假手术组比较均有显著性差异(P<0.01)(表1)。

　　2.2 海马区组织学改变 常规HE染色显示，假手术组大鼠海马区神经细胞形态及分布正常。手术组术后1 d海马CA1区锥体细胞形态及数量未见明显变化;术后3 d海马CA1区锥体细胞间隙增大，部份胞核深染，并可见细胞体积缩小，核固缩、破裂;术后7 d海马CA1区锥体细胞排列不规则，数量减少，细胞界限不清;术后2 w海马CA1区锥体细胞形态有明显变化，呈三角形，顶树突延长，核深染;术后4 w海马CA1区大量锥体细胞脱失;术后8 w锥体细胞明显减少;术后12 w锥体细胞排列杂乱，脱失显著;术后16 w锥体细胞排列松散、紊乱，严重脱失，细胞浆内有微空泡形成。

　　2.3 海马PSD95免疫组化改变 正常情况下，PSD95阳性细胞呈深棕色，分布于细胞膜上，胞核不着色。假手术组的各时间点的PSD95阳性细胞分布无明显变化。模型组术后1 d与假手术组类似，随术后缺血时间延长，阳性细胞明显增加，以术后2 w最显著(图1)，此后阳性细胞逐渐减少，术后16 w时最少，且散在分布，层次紊乱，锥体细胞数目减少(图2)。

　　2.4 不同时间点PSD95免疫阳性细胞数比较 见表2。　表1 术后大鼠水迷宫逃避潜伏期测试成绩表达(DAB，×400)表2 模型组与假手术组PSD95免疫阳性细胞数比较(每400×高倍视野

　　3 讨 论

　　PSD95是新近在谷氨酸能突触的突触后致密物质中发现的一种特殊蛋白质，因聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为90～95 kD而命名为PSD95。PSD95本身并无蛋白酶活性，但它能够介导蛋白质间的相互作用，并特异性的与靶蛋白结合，使PSD95在N甲基D天冬氨酸受体(NmethylDaspartic acid receptor，NMDAR)和突触膜表面蛋白之间起中介作用，在突触水平对兴奋性信号转导进行整合。已知NMDAR参与了海马CA1区长时程增强(longterm potentiation，LTP)等突触可塑性诱导及学习和记忆机制，而研究发现，PSD95在此过程中具有关键性作用。敲除PSD95基因的小鼠会出现LTP诱导障碍及学习和记忆能力下降。然而，在缺血缺氧时，抑制PSD95的表达或PSD95与NMDAR的结合则对兴奋性毒性和缺血性脑损伤有保护作用〔5〕。因此，PSD95的调控作用对突触功能和神经元的存活均有明显的作用。

　　在本实验中，双侧颈总动脉永久性结扎术后，PSD95显示出先升后降的变化规律，于术后3 d开始升高，术后2 w升至高峰，此后渐次下降。关于PSD95表达的增加，已有文献报道，认为PSD95直接参与了早期缺血引起的改变，包括缺血区域PSD95蛋白产生明显增加，超微结构变化，PSD95与其关联的蛋白溶解性降低，PSD5沉降特性改变等。然而，缺血引起的PSD95及其相关蛋白特性改变的机制是复杂和多方面的，例如突触后细胞Ca2+浓度改变、去磷酸化反应、蛋白酶激活、氧化反应和其他改变等，促使神经细胞兴奋性增强而导致细胞死亡〔6，7〕;此外，神经元长期低代谢也会影响神经传递，这似乎可以解释缺血慢性期PSD95表达减少的情况。

　　研究表明，当PSD95含量减少时，会出现海马依赖的学习记忆功能的缺陷〔8〕。在本实验中，结合前面测得的水迷宫结果，即术后4 w时，模型鼠的智力即有明显下降，而PSD95在术后4 w时还处于过表达状态，以上提示术后4 w时，PSD95对缺血信号的转导强势于对学习记忆信号的传递，而此后，在慢性低灌注阶段，随着PSD95进行性下降，其水迷宫成绩也越来越差。因此，由于PSD95整合NMDAR突触信号的功能，在缺血早期，PSD95增加，传递了NMDAR过表达介导的神经毒信号;在缺血晚期，PSD95减少，联系NMDAR于学习记忆的传导通路上的功能变弱，从而导致VD的发生。Hou等也认为PSD95通过介导NMDAR与非受体酪氨酸蛋白激酶(Src、Fyn等)之间的磷酸化作用，可显著增强NMDAR通道的功能，不仅参与生理条件下长时程突触增强的调节，还介导了病理条件下的谷氨酸兴奋性毒性，上调NMDAR的功能，加重细胞损伤〔9，10〕。

　　此外，PSD95这种随时间变化的双相表达与笔者先前研究的NMDAR2B亚单位的变化非常类似〔11〕，提示二者之间存在某种协同，也体现了PSD95转导NMDAR信号的功能，进而也证明PSD95可以成为治疗VD的新的靶点。

参考文献

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　　9 Hou XY，Zhang GY，Yan JZ，et al.Activation of NMDA receptors and Ltype voltagegated calcium channels mediates enhanced formation of FynPSD95NR2A complex after transient brain ischemia〔J〕.Brain Res，2002;955：12332.

　　10 Hou XY，Zhang GY，Zong YY.Suppression of postsynaptic density protein 95 expression attenuates increased tyrosine phosphorylation of NR2A subunits of NmethylDaspartate receptors and interactions of Src and Fyn with NR2A after transient brain ischemia in rat hippocampus〔J〕. Neurosci Lett，2003;343：1258.

　　11 何 雨，张 昱，马飞煜.血管性痴呆大鼠NMDAR变化机制的研究〔J〕.中风与神经疾病杂志，2007;24(120)：1868.