重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

　　 作者：丁克祥 董萍 郑永晨 杨永鹏 朱晓亮 韩晋云 单志新 丁宇 丁振华

【摘要】 目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aY2转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白，并经SDSPAGE检测和Western 印迹鉴定，表达产物包涵体经Ni2+NTA亲和层析纯化。然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y2受体蛋白。结果 经IPTG诱导含有pET28aY2重组质粒的DE3菌，表达出重组人Y2融合蛋白。重组蛋白经Ni2+NTA亲和层析进行纯化后，得到了较高纯度的融合蛋白。经相关在线软件分析后获得了Y2受体的相关生物学特性。结论 重组质粒pET28aY2在大肠杆菌DE3中成功表达，亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白，并对Y2受体蛋白的生物学特征进行了预测，为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础。

【关键词】 人神经肽Y Y2受体;融合蛋白;包涵体;纯化;生物信息学

　　【Abstract】 Objective To express human Y2 receptor protein in E. coli，purify and identify it，and conduct bioinformatic analysis of Y2 receptor protein. Methods The recombinant plasmid pET28aY2 which had been well constructed and sequentially confirmed was transplanted into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG to express fusion proteins. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify the expressed fusion proteins. The inclusion body of the expressed product was purified by Ni2+NTA affinity chromatography. Then bioinformatic analysis of the Y2 receptor was conducted with the help of related online software. Results After being induced by IPTG，the DE3 with recombinant plasmid pET28aY2 expressed recombinant human Y2 receptor protein. Highly purified fusion protein was obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Related biological characteristics of Y2 receptor were obtained after the online software analysis. Conclusions The recombinant plasmid pET28aY2 can be successfully expressed in DE3. Highly purified proteins can be obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Y2 receptor′s biological characteristics are predicted， which lays foundation for further studies of Y2 receptor protein′s biological function and antibody development.

　　【Key words】 NeuropeptideY Y2 receptor; Fusion protein; Inclusion body; Purification; Bioinformatics

　　神经肽Y(NPY)是由36个氨基酸组成的多肽，属于胰多肽家族，作为一个信号分子在不同物种间有高度的保守性。人体内NPY相关的受体主要存在于中枢神经组织中，此外在外周组织也有分布。其中与脂肪组织相关的受体主要有Y1、Y2和Y5〔1，2〕。NPY通过与其受体Y2(NPY2R)的作用刺激内皮细胞增殖分化，在血管生成过程中重要的作用〔3，4〕，Kuo等〔1〕的研究表明NPY在脂肪重塑、饮食诱导的肥胖加剧及伴随的代谢综合征形成中有重要的作用。他们认为，NPY与NPY2R相互作用，通过血管生成引起内皮细胞及脂肪细胞的增殖、分化，表明NPY及NPY2R可作为媒介用以增加移植脂肪组织的体积和存活。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 E.coli BL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aY2的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG 均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组人NPY2R融合蛋白的诱导表达 用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aY2的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5 ml LB (Kan+ )液体培养基，37℃振摇培养过夜。次日取培养过夜菌液500 μl 再接种于50 ml选择性LB 液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1 ml后加入IPTG，终浓度为1 mmol/L，37℃继续诱导培养4 h。取加IPTG前和后的菌液各1 ml，12 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50 μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50 μl，混匀，沸水浴5 min，12 000 r/min离心10 min，每个样品取20 μl上样于10%的SDSPAGE凝胶电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2 h，然后脱色，拍照记录结果。

　　1.2.2 包涵体的释放 据上所述，在2 000 ml的摇瓶中装500 ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃，5 000 r/min，离心15 min，收集菌体沉淀;加入25 mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃，12 000 r/min，离心30 min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25 ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃，12 000 r/min，离心细菌冻融液30 min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25 ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超声处理，10 min/次，处理时间30 min;超声处理后，于4℃，12 000 r/min，离心30 min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。

　　1.2.3 包涵体的提纯 于菌细胞裂解沉淀物中加入含4 mol/L尿素的包涵体提纯液25 ml，吹打混匀，室温静置30 min，12 000 r/min离心30 min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。

　　1.2.4 包涵体的裂解 于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25 ml，吹打混匀，室温静置6 h，使包涵体充分裂解，2 000 r/min离心30 min，收集上清液，即为包涵体裂解物。

　　1.2.5 变性蛋白的复性 将收集的包涵体裂解物上清液加入到处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端;将透析袋整体浸没于蛋白复性液，在4℃条件下透析;复性液中的尿素浓度从7～1 mol/L依次递减，在每个尿素浓度梯度复性液中透析3～4 h。每次更换不同尿素浓度复性液之前，需要将透析袋内的样品吸出，4℃，12 000 r/min，离心30 min，再把上清液加入透析袋内，重新扎紧进行透析;透析完毕后，将样品取出，4℃，12 000 r/min，离心30 min，再将上清液加入透析袋，在4℃预冷的PBS中透析20 h;取出透析好的样品，4℃，12 000 r/min，离心30 min，收集上清液即为复性产物。-70℃保存。

　　1.2.6 复性产物的纯化 ①上样：将复性产物缓慢加于已用PBS缓冲液平衡的镍离子亲和层析预装柱中，加样所用的流速要控制在1 ml/min以内;②冲洗：PBS洗涤除去未结合蛋白，冲洗流速应控制在5 ml/min以内;③洗脱：分别用含50、100、150 mmol/L咪唑PBS缓冲液洗脱融合蛋白，流速5 ml/min。

　　1.2.7 纯化产物Western印迹检测 取纯化后产物20 μl上样于10%的分离胶SDSPAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，进行Western印迹分析。一抗为鼠抗人Anti6×His(1∶1 000稀释)，二抗为辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体(1∶5 000稀释)，采用化学发光法显影，于X光片上曝光。

　　1.2.8 生物信息学 对所表达的NPY2R融合蛋白分别利用在线软件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)进行氨基酸组成及理化性质分析;利用在线软件(http://ca.expasy.org/tools/protscale.html)进行疏水性分析;利用在线软件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)进行跨膜分析;利用在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析;利用在线软件(http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)进行二级结构预测;利用在线软件(http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1)对三级结构进行预测;最后利用Harvard大学的在线生物信息学软件(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools /antigenic.html) 进行抗原表位预测。

　　2 结 果

　　2.1 诱导pET28aY2表达NPY2R结果 pET28aY2表达的NPY2R在N端有非NPY2R的36个氨基酸的融合蛋白，其中有6个组氨酸的tag(Histag)，目的蛋白NPY2R由381个氨基酸组成，即pET28a2Y表达的完整融合蛋白由417个氨基酸组成，分子量约47 kD。见图1。

　　2.2 融合蛋白纯化后的鉴定 NPY2R蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS缓冲液可以完全被洗脱，分别进行10%的SDSPAGE电泳鉴定，见图2。

　　2.3 纯化蛋白的Western印迹结果 用化学发光法显影，X光片曝光后可见一清晰条带，表明目的蛋白得到有效表达和纯化，见图3。

　　2.4 NPY2R的生物信息学分析

　　2.4.1 氨基酸组成及理化性质分析 利用http://www.expasy.ch中的Expasy protparam tool对NPY2R的理化参数进行预测。预测编码区编码的氨基酸数目为417个。碱性氨基酸总数(Arg+Lys=35)等于酸性氨基酸总数(Asp+Glu=35) 。预测相对分子量为46.55 kD，等电点pI为7.27。其半衰期在体外哺乳动物网织红细胞为30 h，在酵母体内大于20 h，在大肠杆菌体内大于10 h。不稳定系数为31.63，归类为稳定蛋白(当一个蛋白质的不稳定系数>40时，则该蛋白质不稳定)。

　　2.4.2 疏水性分析 蛋白质分子的基本特性之一是亲水的极性部分在分子的表面，疏水的非极性部分在分子内部。因此，根据每种残基的极性和氨基酸序列就能较容易地了解到一级结构中不同肽段的极性，从而估测出不同肽段在分子内外的定位。用Expasy软件估测了NPY2R极性，结果见图4。横坐标为蛋白质氨基酸残基的序号，纵坐标表示残基的疏水亲水的特性;正值为疏水，负值为亲水。从图中可以看出，NPY2R具有较强的疏水性，位于分子的内部。

　　图4 NPY2R的疏水性分析

　　2.4.3 跨膜性分析 膜蛋白主要有两大类:内膜蛋白和外膜蛋白，内膜蛋白与细胞膜结合的主要方式是肽段直接跨过细胞膜，即跨膜蛋白，另外还可以通过脂肪基与细胞膜发生共价结合，蛋白可在胞内，也可在胞外。跨膜蛋白在细胞中常以离子通道形式存在，执行信号传导或物质转运功能。利用在线软预测，发现有7个跨膜结构区(如图5示，X轴为氨基酸系列位置，Y轴为氨基酸平均疏水指标)。

　　图5 NPY2R的跨膜性分析

　　2.4.4 信号肽分析 将NPY2R蛋白序列提交到在线软件分析NPY2R是否有信号肽存在，输出结果见图6，NPY2R蛋白N端1～70位氨基酸序列中没有发现明显的信号肽酶切位点，Y平均值较低，未发现信号肽序列存在。因此，推测NPY2R不存在信号肽，该蛋白不是分泌蛋白。

　　图6 NPY2R的信号肽分析

　　2.4.5 二级结构分析 预测结果见图7，表明NPY2R蛋白的二级结构由49.40%的α螺旋、13.43%的延伸链、37.17%的无规卷曲组成。

　　图7 NPY2R的二级结构分析

　　2.4.6 三级结构分析 蛋白质高级结构的预测和分析，对理解蛋白质结构与功能之间的相关性有着极其重要的意义。将NPY2R的氨基酸序列提交给SWISSMODEL三级结构预测服务器，未能生成预测的结果。

　　2.4.7 抗原性分析 利用在线软件对NPY2R的抗原性进行分析，结果见图8，有10个抗原决定簇可供选择，以便进行相关实验。

　　图8 NPY2R的抗原性分析

　　3 讨 论

　　NPY2R缺失小鼠能够明显减少摄食、降低脂肪沉积和减轻体重〔5〕，在大鼠和小鼠外周注射NPY2R 抑制剂PYY3236 均可抑制摄食，降低体重，而在NPY2R 缺失模型鼠中却无此作用〔6〕。这表明NPY2R与摄食和肥胖密切相关。为了探明是否NPYNPY2R信号系统能剌激体内脂肪量的增加，研究者使用遗传性的肥胖鼠B6.VLepob/J，这种鼠具有能进行中枢性的调节摄食过量、削弱新陈代谢及减少交感性嗜铬细胞活性的特点。与对照组鼠相比，这些鼠血清NPY水平高出正常值的200%，并且明显地上调腹部皮下脂肪的NPY及其受体Y2的表达。这也支持了一种观点，即循环的NPY来源于脂肪组织。利用腹部皮下脂肪源性的NPY进行处理后，可观察到在肥胖及消瘦鼠体内脂肪组织的质量及体积增加了50%。而相反的是，注射NPY Y2受体拮抗剂可降低肥胖及消瘦鼠体内脂肪量及体积的50%。

　　Baker 等〔7〕研究表明NPY与Y2受体作用可引起机体内新的脂肪生成，并可减少机体对移植脂肪的吸收。他们以鼠及猴为对象进行的研究表明将包有NPY并能稳定释放14 d的缓释药片植入到鼠的皮下组织中，在药片植入的周围会有新的脂肪生成，而且这种脂肪能够至少维持3个月。同时将含有NPY的药片植入到两只猴子腹部的皮下组织中，NPY的用量与给鼠的用量一样，但1个月后通过MRI检测，同样可以观察到脂肪细胞的生成。

　　本课题组在完成重组人源化NPY2R基因克隆及序列分析〔8〕的基础上，将NPY2R基因与pET28α载体连接后表达于DE3中。pET28α表达载体在N端含有HisTag寡聚组氨酸链，因此，表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。本课题组设计的NPY2R融合蛋白N端为36个氨基酸组成的非目的蛋白，其中包含一个Histag，其后的目的NPY2R蛋白有381个氨基酸。即pET28aNPY2R表达的融合蛋白共由417个氨基酸组成，分子量约50 kD左右。用6×histag抗体进行western 印迹鉴定，表明有大量融合蛋白产生。其分子量与NPY2R融合蛋白相符。目前已完成包涵体的裂解、复性及纯化，其生物学活性还有待测定。此外，本课题组利用生物信息学软件对天然NPY2R在一级结构、二级结构、三级结构等多方面进行了分析和预测，并对其生物学性状有了进一步的了解，为今后以NPY2R为对象进行的研究准备了物质及理论基础。但是，对于NPY2R融合蛋白的生物信息学分析尚待进一步研究。

参考文献

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　　3 Rupnick MA，Panigrahy D，Zhang CY，et al.Adipose tissue mass can be regulated through the vasculature〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99：107305.

　　4 Brakenhielm E，Cao R，Gao B，et al.Angiogenesis inhibitor，TNP470，prevents dietinduced and genetic obesity in mice〔J〕.Circ Res，2004;94：157988.

　　5 Sainsbury A，Schwarzer C，Couzens M，et al.Important role of hypothalamic Y2 receptors in body weight regulation revealed in conditional knockout mice 〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99：893843.

　　6 Batterham RL，Cowley MA，Small CJ，et al.Guthormone PYY(3236) physiologically inhibits food intake〔J〕.Nature，2002;418：6504.

　　7 Baker SB，Cohen M，Kuo L，et al.The role of the neuropeptide Y2 receptor in liporemodeling：neuropeptide Ymediated adipogenesis and adipose graft maintenance〔J〕.Plast Reconstr Surg，2009;123(2):48692.

　　8 丁克祥，董 萍，郑永晨，等，与肥胖相关的神经肽Y受体Y2基因的克隆及序列分析〔J〕.国际护理学杂志，2009;28(3):4235.