人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片PTau、PKA影响的实验研究

　　　　作者：李玺 张欣 张智燕 袁海峰 权乾坤

【摘要】 目的 研究人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片磷酸化微管相关蛋白(PTau)、蛋白激酶A(PKA)表达的调控作用。方法 采用冈田酸诱导大鼠培养脑片Tau 蛋白过度磷酸化，制备成AD模型，运用免疫组织化学、图像分析技术等方法，观察人参皂苷Rg1对各组大鼠脑片PTau、PKA表达的影响。结果 模型组PTau、PKA表达水平明显高于空白对照组(P<0.01);人参皂苷Rg1各剂量组PTau、PKA表达水平虽高于空白对照组，但低于模型组(P<0.01或P<0.05)，且大、中剂量组优于小剂量组;人参皂苷Rg1呈一定的剂量依赖性下调PTau、PKA的表达。结论 人参皂苷Rg1能通过降低PTau水平、下调PKA的表达从而减缓神经纤维缠结、老年斑的形成，以发挥抗痴呆的作用。

【关键词】 人参皂苷Rg1 ;阿尔茨海默病;Tau蛋白;蛋白激酶A

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of ginsenoside Rg1 on the expressions of PTau and PKA on the brain slices of AD model rats. Methods AD models were prepared by culturing rat brain slices with okadaic acid to induce Tau protein hyperphosphorylation. The effects of ginsenoside Rg1 on the expressions of PTau and PKA in AD model rat brain slices in each group were observed by immunohistochemistry and image analysis technology. Results The expressions of PTau and PKA in model group were significantly higher than those in normal control group(P<0.01). The expressions of PTau and PKA in Ginsenoside Rg1 groups were significantly lower than those in normal control group， but were higher than those in model group(P<0.01 or P<0.05)， and Ginsenoside Rg1 showed a dosedependent reduction PTau， PKA expression. Conclusions Ginsenoside Rg1 plays the role of antidementia through inhibiting the expressions of PTau and PKA and slowing the formation of neurofibrillary tangles.

　　【Key words】 Gensenoside Rg1;Alzheimer′s disease;Protein Tau;cAMPdependent kinase A

　　 人参皂苷Rg1是从人参中提取的一类生物活性成分〔1〕，有增强记忆和认知功能的作用，已成为研究中药抗痴呆的热点之一。磷酸化微管相关蛋白(Protein Tau，PTau)存在于正常人的大脑中，但是Tau 蛋白过度磷酸化参与了神经原纤维缠结(neuro fibrillary tangle，NFT)的形成，成为老年性痴呆(Alzheimer disease，AD)的核心病理变化，并且NFT的数目与AD病人的痴呆程度密切相关。研究表明cAMP依赖的蛋白激酶A(cAMPdependent kinase，PKA)是导致Tau蛋白发生磷酸化的关键激酶〔2〕，本实验参照国内外有关文献〔3～5〕，采用冈田酸(okadaic acid，OA)诱导的大鼠培养脑片方法，建立Tau 蛋白过度磷酸化的AD模型，观察人参皂苷Rg1对PTau、PKA的调控作用，旨在阐明人参皂苷Rg1抗痴呆作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠10只，均清洁级(西安交通大学医学院实验动物中心提供)。鼠龄：4～5 w。体重：110～130 g。每只鼠取400 μm厚海马及皮层脑片5张，随机分为5组：空白对照组，模型组，人参皂苷Rg1大、中、小剂量组(每组10张脑片)。

　　1.1.2 药物与试剂 人参皂苷Rg1购自吉林宏久生物科技股份有限公司，纯度98.99%，使用前溶于生理盐水配成浓度分别为60 mg/ml、120 mg/ml和240 mg/ml的三种溶液。OA购自美国ALEXIS生物制剂公司，纯度98% ，使用前溶于10%二甲基亚砜(dimethy sulphoxide，DMSO)，配制成1 mg/ml DMSO溶液待用。PTau和PKA多克隆抗体及免疫组织化学试剂盒(SABC)购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型的建立

　　1.2.1.1 离体海马脑片的制备 大鼠在6%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉下切开头皮，暴露颅骨，迅速断头，取脑，置于0～4℃经95% O2和5% CO2混合气体饱和的人工脑脊液冰水混合物中，洗净血液并降温后，用振动切片机以振幅8档，速度3档行冠状切片切3～4片海马脑片，厚度400 μm 。然后取海马及皮层脑片，挑选形态较好的脑片置入盛有人工脑脊液的6孔板中培养，温度(32.0±0.5)℃中孵育1～2 h，整个过程持续通入混合氧气(95%O2+5% CO2)。人工脑脊液成分：(mmol/L)(150 NaCl，2 CaCl2，1.2 MgSO4，0.5 Kh3PO4，1.5 K2HPO4，10 glucose，pH7.4) 。

　　1.2.1.2 离体海马脑片的分组 空白对照组、模型组、 人参皂苷Rg1大、中、小剂量组脑片开始均培养于人工脑脊液中不做任何处理，1 h后人参皂苷大、中、小剂量组分别加入浓度为60、120、240 μmol/L的人参皂苷Rg1。培养至3 h时，模型组和各药物干预组分别加入OA至其浓度达到1 μmol/L。至6 h时，取出脑片。

　　1.2.2 标本制备及检测指标

　　1.2.2.1 标本制备 取出的脑片迅速经人工脑脊液清洗后，用4%多聚甲醛固定4 h，取出，转入30%蔗糖溶液浸泡至沉底，做冰冻切片，切片10 μm厚，每张切片含皮层、海马、齿状回，然后进行免疫组化染色。

　　1.2.2.2 指标检测 组织切片经抗原修复，3% h3O2阻断内源性过氧化物酶10 min ，一抗PTau(ser202)1∶100，一抗PKA 1∶100，4℃过夜，生物素标记的二抗和SABC 试剂各在室温下作用30 min ，最后DAB 显色，苏木素轻度复染，PBS 代替一抗作阴性对照。分别检测各组脑片皮层、海马、齿状回的PTau、PKA阳性表达情况，采用Qwin550CW图像信号采集与分析系统进行灰度分析， 每张切片同一区域中，随机选取6个视野，检测面积相同，取其平均值作为该切片目标区域的平均灰度值。

　　1.3 统计学方法 使用SPSS11.0统计软件，采用单因素方差分析法和LSDt检验。

　　2 结 果

　　2.1 OA对大鼠培养脑片PTau、PKA表达的影响 与空白组比较，模型组PTau阳性反应物质表达增加(P<0.01)，模型组PKA阳性反应物质除齿状回外其他部位表达明显增加(P<0.01)。见表1、表2。

　　2.2 人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片PTau表达的影响 与模型组比较，人参皂苷Rg1各剂量组PTau阳性反应物质均有不同程度减少(P<0.05或P<0.01);人参皂苷Rg1各剂量组之间比较，在除CA3和齿状回外的其他脑区大剂量组较中、小剂量组更有效降低各区PTau的表达(P<0.05或P<0.01)。见表1，图1。

　　2.3 人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片PKA表达的影响 人参皂苷Rg1各剂量组与模型组比较，PKA表达均有不同程度减少(P<0.05或P<0.01);人参皂苷Rg1各剂量组之间比较，CA1区大剂量组和小剂量组间有差异性(P<0.05)，其余各区两剂量组无明显差异(P>0.05)，在各脑区中、小剂量组之间无明显差异性(P>0.05)。见表2，图2。表1 人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片PTau表达的影响表2 人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片PKA的影响(x±s，灰度值)

　　3 讨 论

　　NFT是AD患者脑内主要病理改变之一，其产生的原因是Tau蛋白的过度磷酸化。正常情况下Tau蛋白磷酸化和去磷酸化处于平衡状态，Tau蛋白过度磷酸化后，其促进微管组装的生物活性就会丧失，导致细胞骨架的结构异常而形成NFT。PKA可直接参与tua蛋白过度磷酸化。PKA在体外可使重组Tua蛋白多个位点(Ser214、Ser409 、Ser262)磷酸化，改变其空间结构，释放或隐蔽其他可被磷酸化的位点，从而增强或抑制其他激酶对Tua蛋白的后续磷酸化作用〔2〕。

　　本实验以OA诱导大鼠培养脑片Tau蛋白过度磷酸化，模型组大鼠脑片的HE染色可见少量细胞结构的破坏，及少量胶质细胞增生，未见细胞层厚度的变化，与文献报道一致〔6〕;模型组大鼠脑片的免疫组化染色可见PTau阳性反应物质表达比空白对照组明显增加，表明成功建立AD模型。本实验发现人参皂苷Rg1各剂量组PTau、PKA的表达比模型组明显降低，表明人参皂苷Rg1能有效减轻OA引起的Tau蛋白过度磷酸化，从而减轻NFT的形成。人参皂苷Rg1各剂量组之间比较，PTau、PKA的表达随人参皂苷Rg1剂量的增加而减少，表明人参皂苷Rg1干预呈现量效关系下调PTau、PKA的表达。本实验从代表AD本质病理变化的NFT形成方面，揭示了人参皂苷Rg1抗痴呆作用机制，为人参皂苷Rg1治疗AD的研究提供了新靶点、新思路。

参考文献

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