依折麦布对兔动脉粥样硬化作用的实验研究

　　　　作者：王中群 李丽华 张哲莹 赵琪 曾莹 吕运成 赵卫星 张景航

【摘要】 目的 探讨依折麦布对新西兰兔动脉粥样硬化斑块的影响。方法 将24只雄性新西兰白兔随机分为对照组、模型组、依折麦布干预组，每组8只。对照组喂普通饲料，模型组喂高胆固醇饲料(高胆固醇饲料由普通饲料加2%胆固醇配制)，依折麦布干预组在高胆固醇饲料中加入5 mg·kg-1·d-1依折麦布，连续饲喂12 w，以镜下见到内膜增生和明显的脂斑突起作为模型制备成功的标志。HE染色观察主动脉病理形态学改变，油红O染色和高效液相色谱观察主动脉平滑肌细胞内脂质蓄积情况，RTPCR检测主动脉平滑肌细胞脂质代谢相关基因CD36、周脂素和三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATPbinding cassette transporter A1，ABCA1)mRNA的变化;westernblot观察细胞膜ABCA1、蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)蛋白表达;PepTag○RAssay法检测细胞膜PKC活性。结果 依折麦布可使新西兰兔动脉粥样硬化病变区内膜变薄、脂质蓄积减少进而逆转斑块的演进;相对于50 μg/ml oxLDL处理24 h的新西兰兔主动脉平滑肌细胞，3 μmol/L依折麦布可有效逆转oxLDL诱导的平滑肌源性泡沫细胞的形成，使细胞内CE/TC比值降至39.6%。依折麦布可显著下调平滑肌细胞CD36、perilipin和PKCα的表达，上调胞膜ABCA1的表达。3 μmol/L依折麦布可下调主动脉平滑肌细胞胞膜PKC活性至基线附近。结论 依折麦布可能通过对PKC/CD36/ perilipin/ ABCA1这些脂质蓄积调控子的影响，发挥抗动脉粥样硬化效应。

【关键词】 动脉粥样硬化;脂质蓄积;蛋白激酶C;依折麦布

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)性心脑血管病的演进过程中，血管壁平滑肌细胞移行增殖并蓄积脂质形成泡沫细胞是一个重要环节〔1〕，能有效抑制这一环节并促进细胞内胆固醇逆向转运的药物研发一直是动脉粥样硬化研究关注的热点。依折麦布作为一种新型选择性胆固醇吸收抑制剂，在临床应用中因其可有效弥补他汀类药物的不足而倍受青睐〔2〕，但其抗动脉粥样硬化的具体分子机制尚不明了。本研究制备新西兰兔动脉粥样硬化模型和新西兰兔主动脉平滑肌源性泡沫细胞模型，观察依折麦布对斑块消退、细胞内脂质清除以及脂质蓄积调控子〔CD36、周脂素(perilipin)、三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATPbinding cassette transporter A1，ABCA1)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)〕的影响，探讨依折麦布抗动脉粥样硬化作用的分子机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 雄性新西兰兔24只，体重1.85～2.39 kg，由南华大学提供，许可证号SCXK(湘)20040009)。饲以普通饲料，适应环境1 w。根据血清总胆固醇水平，随机分为对照组、模型组、依折麦布干预组，每组8只。

　　1.2 试剂与仪器 胆固醇购自湖南祁东同信生化厂;依折麦布购自美国先灵葆雅(ScheringPlough)制药公司(批号h30060113)。总RNA提取试剂盒TRIzol购自上海Sangon公司;ImPromⅡTM Reverse Transcriptase、PepTagR○NonRadioactive PKC Assay Kit 和BCATM Protein Assay Kit购自Promega;MasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒购自北京天为时代;所有引物由上海生工生物工程服务有限公司合成;ABCA1、GAPDH一抗、辣根过氧化物酶标记二抗及Western Blotting Luminol Reagent购自Santa Cruz;Oil Red O购自Sigma公司;Shandon325型切片机，Olympus倒置光学显微镜，UVP凝胶成像分析系统，Eppendorf台式多功能高速冷冻离心机，BioRad垂直、水平电泳仪及转膜系统。

　　1.3 实验步骤 对照组喂普通饲料，模型组喂高胆固醇饲料(高胆固醇饲料由普通饲料加2%胆固醇配制)，依折麦布干预组在高胆固醇饲料基础上加入5 mg·kg-1·d-1依折麦布，连续饲喂12 w，以镜下见到内膜增生和明显的脂斑突起作为模型制备成功的标志。

　　1.4 低密度脂蛋白的分离、氧化修饰及鉴定 参照文献〔3〕的方法制备低密度脂蛋白。取新鲜人血浆100～200 ml，加入PDB以防腐抗氧化，置超速离心机作序列超速离心。提纯的LDL在含200 μmol/L EDTA的磷酸缓冲液(PBS)中透析48 h，BCA法蛋白定量，CuSO4氧化，鉴定后过滤除菌，调蛋白浓度至1 g/L，4℃保存。

　　1.5 病理形态学分析 颈总动脉放血处死动物，取出兔主动脉。PBS漂洗3次，用10%福尔马林固定、梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋、切片(厚度3 μm)，HE染色观察动脉粥样硬化病变的形成。

　　1.6 主动脉平滑肌细胞培养及处理 无菌条件下取兔主动脉，PBS冲洗3～5遍，剥去动脉外膜，纵行剖开血管，小心刮去内膜，用DMEM培养液冲洗一次。剪成1 mm3左右的组织块，用弯头接种针将组织块移入25 ml培养瓶壁上，加入含20%小牛血清的DMEM培养液5 ml于对侧瓶底，入培养箱孵育4～6 h，然后轻轻翻转培养瓶，使培养液盖过组织块。此后每3 d换液一次。2 w左右可见VSMC贴壁长出，待原代细胞融合成致密单层时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取4～7代VSMC用于实验或液氮中冻存。实验分为对照组(DMEM培养基24 h)、oxLDL处理组(用50 μg/ml oxLDL+DMEM培养基孵育24 h)、依折麦布干预组(用50 μg/ml oxLDL+3 μmol/L依折麦布+DMEM培养基孵育24 h)。

　　1.7 油红O染色 将主动脉平滑肌细胞培养于放有盖玻片的6孔培养板内，按照主动脉平滑肌细胞培养及处理方法处理24 h后吸弃旧的培养基，用PBS液冲洗3次，每次5 min;50%异丙醇固定1 min，油红O染色10 min，苏木素衬染5 min，盐酸酒精分色;水性封片剂封片，显微镜观察;细胞内脂滴呈红色，细胞核呈蓝色，图像分析系统收集图像并于显微镜下摄像保存。参照文献〔4〕方法进行脂滴染色的半定量分析，即根据细胞脂滴的面积进行细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-”;细胞脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+”即为油红O染色细胞。每块玻片计数100个细胞。

　　1.8 高效液相色谱分析 将经过处理的平滑肌细胞吸弃旧培养基，PBS洗2次，加入1 ml 0.9%NaCl溶液，细胞刮子收集细胞。冰浴中超声破碎细胞;BCA法测定蛋白含量。参照文献〔5〕方法进行高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。采用C18柱以异丙醇:正庚烷:乙晴为流动相进行非梯度洗脱，流速1 ml/min，柱温保持4℃，216 nm检测8 min。以峰面积定量游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)，总胆固醇(TC)量为游离胆固醇量加上胆固醇酯的量。

　　1.9 PepTag○RAssay 将处理后的平滑肌细胞提取胞浆胞膜蛋白，BCA蛋白检测试剂盒定量后参照文献〔6〕方法进行PepTag○RAssay操作。可见/紫外分光光度计读取570 nm的吸光度值，以液化的不含PepTag○R Peptide的琼脂糖作为空白值。根据试剂盒提供的数据和Beer′s定律A=∑BC(A样品吸光度;肽的摩尔吸收率L·mol-1·cm-1;B比色杯宽度;C样品中肽浓度mol/L)逐步计算酶活性(1单位酶活性指每毫升溶液中的磷酸盐每分钟转移至底物的纳摩尔数量)。

　　1.10 逆转录聚合酶链反应RTPCR 用TRIzol试剂提取经过处理细胞的总RNA。用ImPromⅡTM Reverse Transcriptase合成cDNA，再取逆转录产物10 μl进行PCR循环。CD36引物序列：5′CTCCCAAAGTGCTGGGATTA3′(前向)，5′AGCCTTTGGGGGTCTTTCTA3′(反向)，扩增片段243 bp;内参照 βactin 引物序列：5′ATCCCTGTACGCCTCTGG3′(前向)，5′TCCTTCTGCATCCTGTCG3′(反向)，扩增片段500 bp。PCR反应条件为：95℃ 5 min预变性，95℃ 30 s变性，53℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，35个循环，72℃ 5 min继续延伸。ABCA1引物：5′TAAACGCCCTCACCAAAGAC3′(前向)，5′AGCCGCCATACCTAAACTCA3′(反向);94℃1 min，63℃1 min，72℃ 1 min，共34个循环，扩增片段409 bp。perilipin引物序列5′CTTTCTCGACACACCATGCAAACC3′(前向)，5′CCACGTTATCCGTAACACCCTTCA3′(反向);94℃ 1 min变性，55℃ 45 s退火，72℃ 45 s延伸，28个循环，扩增片段385 bp。反应结束后琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶图像分析系统进行积分吸光度测定和分析，以各组目的基因与内参照基因吸光度值比值比较待测基因mRNA的表达差异。

　　1.11 Western 免疫印迹检测 将提取的细胞胞膜蛋白BCA蛋白定量并煮沸变性后，参照文献〔6〕方法进行ABCA1、PKCα和内参照GAPDH的蛋白免疫印迹检测。蛋白条带采用UVP凝胶图像分析系统分析，以各组目的蛋白与内参照蛋白吸光度值的比值比较待测蛋白的表达差异。

　　1.12 统计学方法 所得数据采用x±s表示，组间比较采用方差分析及t检验，所有数据用SPSS11.0软件分析。

　　2 结 果

　　2.1 依折麦布对新西兰兔动脉粥样硬化的影响 主动脉石蜡切片HE染色显示，饲喂12 w后对照组主动脉内膜光滑，内皮细胞完整，中膜主要由呈波浪状同心排列的弹性纤维膜构成，基质内可见环形的平滑肌细胞;模型组主动脉内膜以及中膜显著增厚，内皮下间隙蓄积了大量的脂类物质和坏死性物质，中膜弹性纤维层结构不清，细胞排列紊乱;与模型组比较，依折麦布干预组主动脉内膜和中膜明显变薄，内皮下间隙蓄积物质减少，但仍有蓄积，中膜结构也渐趋好转(图1)。提示依折麦布可以抑制或者逆转高胆固醇饮食诱导的动脉粥样硬化。

　　图1 依折麦布对新西兰兔动脉粥样硬化的影响(HE，×400)

　　2.2 依折麦布对新西兰兔主动脉平滑肌细胞泡沫化过程的影响 主动脉平滑肌细胞原代培养并传4～7代后应用50 μg/ml oxLDL或50 μg/ml oxLDL+3 μmol/L依折麦布处理24 h后，油红O染色显示细胞浆内出现红染的小球状脂滴(图2)。脂滴半定量分析结果显示，对照组、oxLDL处理组和依折麦布干预组油红O染色细胞分别为(13±2) 、(68±9)、(31±4)个。与oxLDL处理组比较依折麦布干预组油红O 染色细胞数明显减少(P<0.05)。高效液相色谱分析显示，50 μg/ml oxLDL处理24 h后主动脉平滑肌细胞内CE与TC比值高达57.1%，已经演变为平滑肌源性泡沫细胞;而依折麦布干预组细胞内CE和TC显著下调，CE/TC下降至39.6%。提示依折麦布可以减少主动脉平滑肌细胞内胆固醇酯和脂滴的蓄积，进而逆转平滑肌源性泡沫细胞的形成(表1)。

　　2.3 依折麦布对新西兰兔主动脉平滑肌细胞内脂质蓄积调控子的影响 见图3、表2。RTPCR结果显示，与oxLDL处理组比较，依折麦布干预组CD36和perilipin mRNA 表达下调，ABCA1 mRNA表达上调。提示在依折麦布抵抗泡沫细胞演进过程中，脂质蓄积的调控子CD36、perilipin和ABCA1可能发挥了重要的作用。表1 依折麦布对新西兰兔主动脉平滑肌细胞胆固醇蓄积的影响与对照组比较：1)P<0.05，与oxLDL处理组比较：2)P<0.05;下表同表2 依折麦布对新西兰兔主动脉平滑肌细胞脂质蓄积调控子的影响

　　胞膜PKCα表达的影响2.4 依折麦布对新西兰兔主动脉平滑肌细胞膜PKC活性和PKCα表达的影响 对照组、oxLDL处理组和依折麦布干预组新西兰兔主动脉平滑肌细胞胞膜PKC活性依次为(0.311±0.032)、(0.975±0.081)、(0.425±0.062)U/ml，组间比较差异显著(P<0.05)。Western蛋白印迹分析显示，与oxLDL处理组比较，依折麦布干预组平滑肌细胞胞膜PKCα表达下调(图4，表2)。提示信号转导的关键酶PKC也受到了胆固醇的诱导和依折麦布的调控。

　　3 讨 论

　　动脉粥样硬化的典型病理学特征是动脉壁内皮下间隙脂质沉积、内膜增厚乃至最终出现血管腔的狭窄。沉积的脂质主要来源于血浆胆固醇和泡沫细胞(巨噬细胞、平滑肌细胞吞噬脂质达到细胞内CE/TC>50%即成为泡沫细胞)的崩解〔1〕，如何有效地抑制甚或逆转泡沫细胞的形成成为防治动脉粥样硬化的关键。本研究前期动物实验显示，连续12 w 5 mg·kg-1·d-1依折麦布的可有效减轻新西兰兔主动脉粥样硬化的病变程度内膜变薄，内皮下间隙脂质以及坏死物质减少，血管壁结构得到了有效的改善。油红O染色和高效液相色谱分析显示，新西兰兔主动脉平滑肌细胞原代培养并传4～7代后，用50 μg/ml oxLDL处理24 h后平滑肌细胞内小球状红染脂滴增多变大，细胞内CE/TC比值超过50%的临界值，形成典型的泡沫细胞。以此泡沫细胞模型为载体，给予3 μmol/L依折麦布处理24 h后，细胞内油红O染色阳性细胞减少了54.4%，胆固醇酯减少了57.6%，CE/TC比值也降至50%以下。可见依折麦布对平滑肌细胞内脂质蓄积影响最大的当属脂滴和胆固醇酯。已有的研究显示，细胞内50%以上的胆固醇是通过细胞膜上的清道夫受体CD36摄取的〔7〕，摄取的胆固醇等中性脂质在细胞内经过一系列的转化后多余的脂质被perilipin、adipophilin和TIP47等PAT家族蛋白所包裹形成典型的细胞内脂滴〔8〕(油红O染色呈现经典的红色小球状结构)。本研究RTPCR显示，依折麦布对CD36和perilipin的影响与对细胞内脂质蓄积的影响基本一致。说明依折麦布对主动脉内皮下间隙脂质蓄积的影响可能是通过CD36和perilipin来介导的。

　　在动脉粥样硬化的发生发展过程中，胆固醇逆向转运的紊乱是一个重要的诱因。胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)是指介导外周细胞内游离胆固醇流出，然后再通过血液运输到达肝脏，最终胆固醇被转化成胆汁酸排出体外的过程，在这一过程中腺苷三磷酸结合盒转运子A1 (ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)担负着将细胞内胆固醇转运至血浆apoAⅠ的作用〔9〕。本研究RTPCR和Western印迹显示，依折麦布可以上调ABCA1的表达，提示依折麦布对新西兰兔动脉粥样硬化的影响可能还有ABCA1的参与。

　　已有的其他研究显示，CD36、perilipin和ABCA1可能受调于信号转导的关键酶蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)〔10～12〕。静息状态下PKC多位于胞浆，激活时从胞浆转位至胞膜，并经历一系列复杂过程诱导下游底物磷酸化引发相应的生物学功能改变，参与胆固醇的摄取和外排。以往研究显示，PKC在泡沫细胞形成和动脉粥样硬化斑块发展过程中具有一定的调控作用〔5，6〕。本研究PepTagR○Assay法和Western印迹实验显示，依折麦布降低新西兰兔主动脉平滑肌细胞胞膜PKC活性和胞膜PKCα表达，提示PKC参与了依折麦布对新西兰白兔主动脉平滑肌源性泡沫细胞的逆转，但PKC参与依折麦布逆转泡沫细胞的具体机制尚有待研究的进一步深入。

　　综上所述，依折麦布可能是通过对PKC/CD36/perilipin/ABCA1这些脂质蓄积调控子的影响，而达到抑制细胞内脂质蓄积，促进细胞内胆固醇外流，进而使动脉壁胆固醇清除功能加强、血管壁结构改善，发挥有效的抗动脉粥样硬化功能。

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