氯沙坦对阿霉素肾病大鼠肾脏保护作用的研究

【摘要】 目的 探讨氯沙坦对阿霉素肾病肾脏的保护作用及机制。方法 48只Wistar大鼠随机分为对照组、肾衰组、氯沙坦组，每组16只。肾衰组及氯沙坦组大鼠腹腔注射阿霉素4 mg/kg，每周1次，持续5 w，制作阿霉素肾病大鼠模型;对照组应用同样的方法注射生理盐水。模型复制成功后，氯沙坦组大鼠给予氯沙坦1.2 mg/只灌胃，1 次/d;肾衰组给予同等量生理盐水灌胃，1次/d，均连续给药2 w。生化法检测24 h血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)，化学比色法检测肾皮质中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，RTPCR方法检测肾组织AT1、AT2、ACE及AGT mRNA表达。结果 与对照组比较，肾衰组血清BUN、Cr均显著升高，肾皮质中MDA升高，SOD降低(P<0.05);氯沙坦组与肾衰组比较，血清BUN、Cr均显著降低，肾皮质中MDA降低，SOD升高(P<0.05)。与对照组比较，肾衰组肾脏AT1表达上调，AT2降低，AGT和ACE水平增高(P<0.05);氯沙坦组转为AT1下调，AT2表达接近对照组水平，AGT水平降低，ACE水平降低但仍高于对照组水平(P<0.05)。结论 氯沙坦具有延缓阿霉素肾病大鼠肾功能不全进展，减少氧化应激损伤的保护作用。

【关键词】 氯沙坦;阿霉素;肾素血管紧张素系统(RAS);肾功能

　　【Abstract】 Objective To investigate the protecting effect of Losartan on the kidney of the rats with uninephrectomized adriamycininduced nephrosis and study its possible mechanisms. Methods Experimental nephritic syndrome model was induced with repeated peritoneal injections of adriamycin. Rats were randomly pided into control， model(ADR)， losartan (ADR+ARB)groups，respectively. The animal models were injected adriamycin(5 mg/kg) through the abdominal cavityfor 5 w， the control group were injected physiological saline as the same method. The indexes of oxidative stress reaction of the renal cortex， malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD) were measured by chemical chromatometry. The kidney AT1 ，AT2，ACE and AGT mRNA expressions were assayed by RTPCR. Results Compared with those of control group， the levels of blood urine nitrogen (BUN) and serum creatinine (Cr)， MDA were increased， the level of SOD was decreased in ADR group. Compared with those of ADR group， the levels of BUN， Cr and MDA were decreased. The level of SOD was increased in ADR+ARB group. The AT1，ACE and AGT mRNA expressions in ADR group were higher than those of control group. The AT2 mRNA expression was lower than that of control group. The AT1 mRNA expression in ADR+ARB group was lower than that of ADR group， while the AT2 mRNA expression in ADR+ARB group was similar to that in control group. The AGT and ACE mRNA expressions in ADR+ARB group were lower than those of ADR group，while ACE mRNA expression was higher than that of Control group. Conclusions Losarton has protective effects against renal injuries induced by ADR .

　　【Key words】 Losartan; Adriamycin; Reninangiotensin system(RAS); Renal function

　　 血管紧张素Ⅱ型受体拮抗剂(Angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor antagonist，AT1RA)具有降压效果，能够延缓肾脏疾病动物模型肾脏损伤进展，应用于临床延缓肾功能不全进展的治疗中〔1，2〕。氯沙坦(Losartan，ARB)是临床用于延缓肾功能不全进展的血管紧张素Ⅱ型受体拮抗剂，具有良好的疗效，但其对肾脏保护作用的具体机制尚不完全清楚。阿霉素肾病大鼠肾脏组织损伤的演变过程与人类肾脏病肾损害的慢性病理过程相似，本研究建立阿霉素肾病大鼠动物模型，观察给予氯沙坦干预后大鼠肾组织氧化抗氧化成分变化及对RAS系统中AT1、AT2、ACE及AGT 基因表达变化，探讨其对肾脏的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 健康清洁级近交系雌性Wistar大鼠，48只，3月龄，体重(180±20)g，(由吉林大学医学动物繁育中心提供)，适应性喂养1 w。随机分为对照组、肾衰组、氯沙坦组，每组16只。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂与仪器 Trizol(购自美国Invitrogen公司)，逆转录酶(购自大连宝生物工程公司)，2×PCR mix(购自北京天根公司)，阿霉素(购自美国Sigma公司)，氯沙坦(购自杭州默沙东制药公司)，MDA、SOD检测试剂盒(购自南京成生物工程研究所)，全自动生化分析仪(购自日本Olympus公司)，引物由大连宝生物工程公司合成。

　　1.2.2 模型制备 肾衰组和氯沙坦组腹腔注射阿霉素，每次4 mg/kg，每周1次，持续5 w，出现大量蛋白尿提示肾病动物模型制备成功。对照组注射相同体积生理盐水，持续5 w。

　　1.2.3 给药方法 造模成功后，氯沙坦组大鼠给予氯沙坦1.2 mg/只灌胃，1 次/d;肾衰组给予同等量生理盐水灌胃，1次/d。所有动物均连续给药2 w，于治疗结束后，在腹腔麻醉下取双肾冻存于液氮。

　　1.2.4 检测指标 处死动物，收集血液，分离血清，3 000 r/min离心15 min，保存于-20℃冰箱待测。血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)含量(mmol/L)采用生化分析方法检测，均用Olympuls AU640型全自动生化分析仪测定。取肾组织液氮研磨匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清，用黄嘌呤氧化酶法测定肾组织SOD活性，用硫代巴比妥酸法测定肾组织MDA含量，并用蛋白含量校正。

　　1.2.5 AT1、AT2、ACE和AGT mRNA的表达 依据Trizol说明书操作，提取大鼠肾组织总RNA，分光光度计测定RNA质量和浓度。每组均按照AMV逆转录说明书取5 μg总RNA进行逆转录，取2 μl逆转录反应产物进行PCR扩增。引物序列：AT1正义：5′GCACAATCGCCATAATTATCC3′，反义：5′CACCTATGTAAGATCGCTTC3′，产物445 bp;AT2正义：5′GTGTCCAGCATTTACATCTTCA3′，反义：5′CACCAAACAAGGGGAACTAC3′，产物275 bp;ACE正义：5′GCAGAACTTCACTGACCAAAAG3′，反义5′TCAAAGGAGGGGGACTCATA3′，产物383 bp;AGT正义：5′TTGTTGAGAGCTTGGGTCCCTTCA3′，反义：5′CAGACACTGAGGTGCTGTTGTCCA3′，产物265 bp;GAPDH正义：5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′，反义：5′AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC3′，产物617 bp。使用2×Taq master 12.5 μl，cDNA 2 μl，引物各10 pmol，用ddh3O将反应体系补齐为25 μl反应体系。取10 μl扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶进行DNA电泳。采用凝胶成像系统拍照并分析条带吸光度(A值)。

　　1.3 统计学处理方法 采用SPSS11.0 软件分析。计量资料实验数据以x±s表示，单变量配对资料之间的比较采用配对样本t检验。

　　2 结 果

　　2.1 血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)含量变化 与对照组比较，肾衰组血清BUN明显增加(P<0.05)，氯沙坦组则明显低于肾衰组(P<0.05);肾衰组血清Cr明显增加(P<0.05)，氯沙坦组则明显低于肾衰组(P<0.05)。见表1。表1 血清BUN、Cr的含量与对照组比较：1)P<0.05，与肾衰组比较：2)P<0.05，下表同

　　2.2 肾皮质MDA、SOD含量变化 与对照组比较，肾衰组大鼠肾皮质MDA含量明显增加(P<0.05)，氯沙坦组则明显低于肾衰组(P<0.05);肾衰组大鼠肾皮质SOD含量明显增加(P<0.05)，氯沙坦组则明显低于肾衰组(P<0.05)。见表2。

　　2.3 肾组织中肾组织AT1、AT2、ACE、AGT mRNA的表达 肾衰组肾脏AT1表达上调，AT2降低，氯沙坦组转为AT1下调，AT2表达接近对照组水平;血管紧张素转化酶(ACE)在肾衰时表达上调，给予氯沙坦后降低，但仍高于对照组水平;与对照组比较，肾衰模型血管紧张素原(AGT)水平增高，而给予氯沙坦后其水平降低。见图1，表3。表2 肾皮质MDA、SOD的含量表3 肾组织AT1、AT2、ACE、AGT mRNA表达比较

　　3 讨 论

　　AT1RA类药物(angiotensin receptor blocker)是临床最常用、疗效确切能延缓肾功能不全进展的一类药物，其作用机制是抑制AngⅡ与其受体结合，降低循环血压和肾小球内压〔3〕。血中BUN、Cr水平在一定程度上可反映肾小球的滤过功能。本研究显示，肾衰大鼠肾小球滤过功能严重下降，而进行氯沙坦干预治疗能够改善肾小球滤过功能，延缓肾功能不全的进展，具有肾脏保护作用。氯沙坦是一种非肽类口服药，可以特异性阻断AngⅡ和AT1受体的结合，近年来氯沙坦在治疗高血压、心力衰竭、心肌缺血、糖尿病肾病和改善胰岛素抵抗等方面应用较多。在RAS系统中，血管紧张素原(AGT)通过肾素转变成血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)， AngⅠ通过血管紧张素转化酶(ACE)的酶解作用生成血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，是RAS主要活性肽 〔4〕。AngⅡ可作用于血管紧张素受体AT1和AT2，是肾损伤中重要的调节因子。研究证实，AngⅡ主要通过激活NADPH氧化酶和增加线粒体内ROS来刺激细胞内ROS的生成〔5，6〕。

　　本研究显示，脂质过氧化反应参与了大鼠阿霉素肾病病理过程，且机体抗氧化能力减退，而氯沙坦可通过改善肾病机体氧化应激状况发挥肾脏保护作用。本研究发现，肾衰组肾脏AGT、ACE水平升高，AT1表达增高，AT2降低，氯沙坦组转为AT1下调，AT2表达接近对照组水平。提示肾损伤时，由于AGT、ACE水平增高，增高的AGT在ACE作用下可大量生成AngⅡ;同时，由于AT1水平升高，Ang Ⅱ与AT1结合通过其缩血管作用影响肾脏血流动力学，促进肾脏病的进展，也经其诱导单核细胞活化、促进巨噬细胞和血管平滑肌细胞分泌炎症介质加重细胞损伤，肾脏一些炎症表现主要与AT1水平升高或活性增强有关〔7，8〕。由于AT2主要抑制细胞生长、分化，并介导血管扩张，因而肾衰时AT2下调使其功能减弱，可经减少肾血流方式促进了肾组织损伤，二者表达失衡可能在肾损伤的发病机制和靶器官的损害过程中发挥重要作用。氯沙坦可竞争性抑制Ang Ⅱ与其受体结合，且主要与AT1结合，阻断AngⅡ引起的血管收缩、交感兴奋、醛固酮分泌增多等作用，因而可以缓解肾损伤〔9〕。并且氯沙坦下调节AT1而上调节AT2，说明氯沙坦亦可从调节受体水平角度对抗Ang Ⅱ的作用。

　　综上，氯沙坦通过拮抗AngⅡ，对阿霉素肾病大鼠肾脏具有延缓肾功能不全进展的保护作用，其作用可能与氧化应激反应密切相关。

参考文献

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