痰瘀证的血清蛋白质指纹图谱的临床研究

【摘要】 ［目的］分析痰瘀证患者血清蛋白质指纹图谱，探讨痰瘀证患者血清多肽蛋白表达的差异性。［方法］应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDITOFMS）及弱阳离子交换蛋白质芯片（weak cationic exchanger protein chip）技术检测14例痰瘀证患者和16例性别、年龄匹配的正常对照组血清，获得血清蛋白质指纹图谱。［结果］痰瘀证组与正常对照组之间检测到18种差异蛋白（P<0.05）。［结论］痰瘀证患者血清中存在一些差异表达蛋白质。

【关键词】 痰瘀证；蛋白质；指纹图谱

Abstract：［Objective］To observe the serum albumin fingerprint spectrum of sputum stasis syndrome and explore the disparity of its polypeptide albumin expressions.［Method］Apply SELDITOFMS and weak cationic exchanger protein chip to test 14 cases and 16 normal persons’ serum for fingerprint spectrum.［Result］There’re 18 kinds of disparity albumin between patients and normal persons.［Conclusion］Sputum stasis patients have some different expressed albumin in serum.

　　Key words：sputum stasis syndrome；albumin；fingerprint spectrum

　　所谓“证”，是指在疾病发展过程中，某一阶段的病理概括。它包括病的原因（如风寒、瘀血、痰饮等等）、病的部位（如表、里、某脏、某腑等等）、病的性质（如寒、热等等），反映了疾病过程中该阶段病理变化的全面情况。笔者应用SELDITOFMS及蛋白质芯片技术从蛋白质指纹图谱角度探讨痰瘀证本质及发病机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　14例为2008年1月至2008年12月浙江省人民医院中医科门诊病人，诊断标准根据《中医诊断学》中关于痰证和瘀证的诊断标准拟定，主要以舌象的舌质紫暗、舌苔滑腻和脉象的脉涩为诊断依据。其中男13 例，女1例；年龄25～69 岁，平均（47）岁。选择16例正常健康人为对照组，其中男15例，女1例；年龄28～65岁，平均（46.5）岁。2组年龄、性别等资料经统计学处理无显著性差异，具有可比性。

　　1.２ 材料和方法

　　（1）材料：尿素、乙腈、三氟乙酸、TrisHCl pH9.0、CHAPS、DTT、NaAc、HPLC h3O 和sinapinic acid（SPA）等均购自Sigma公司。（2）方法：①血清标本处理：14例痰瘀证患者和16例正常健康人各空腹采集静脉血3ml，采集后立即于4℃低温冰箱静置2h， 4℃，4000r/min离心10min分离血清，将血清于4℃，12000r/min再次离心5min，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为每管100μl，保存于-80℃冰箱。实验检测血清均仅一次冻融。从-80℃冰箱中取出血清样品，于4℃，10000 r/min，离心5min；取血清10μl，加入20μlU9缓冲液（9M Urea，2% CHAPS，50mM TrisHCl，pH9.0）稀释，而后，将以上标本冰浴振荡30min，400r/min；将30μl上述变性后标本加入360μl相应的结合缓冲液混匀，待用。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。②WCX2操作简要步骤：将200μl结合缓冲液（50mM NaAc，Ph4.0）加至已装好WCX2的Bioprocessor（美国Ciphergen公司）中，置振荡器（MS1 Minishaker）400～600 r/min震荡 5min，甩掉缓冲液。重复上述操作两次。在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的标本，置振荡器400～600 r/min，4℃震荡1h；甩出标本。 每孔加入200μl结合缓冲液，室温置振荡器400～600 r/min，震荡 5min，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200μl，重复操作一次。立刻拆开芯片处理器，取出芯片，待干后，在每个加样孔上加SPA0.5μl，干燥后再重复加SPA0.5μl一次，然后用蛋白质指纹图谱仪（SELDITOFMS，美国Ciphergen公司）阅读芯片。③蛋白质指纹图谱的测定参数和标化：在读取数据前，用加有allinone标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，使分子误差<0.1%。本研究中阅读仪的主要参数设定：最佳激光强度240，最佳检测灵敏度8；设最高检测分子质量为50Da，最佳状态从1Da到15000 Da；蛋白质指纹图谱的标化参数：蛋白峰范围质荷比（m/z）2000～45000；m/z为6634.8的蛋白为所有蛋白谱的共有蛋白，作为校正的内参照。

　　1.３ 统计学处理

　　蛋白质指纹图谱统计用Ciphergen Protein Chip软件，数据输入计算机，两样本总体方差齐同时，两样本均数用t检验； 两样本总体方差不齐同时，两样本均数用近似t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 实验结果

　　14例痰瘀证患者血清蛋白质指纹图谱建立后，在（m/z）2000～45000Da范围内，与正常对照组比较，共检测出18种差异表达蛋白（P<0.05），m/z为2757、4477、6635、6885、7976 、8694 、8898 、 8943 、 13749 、13956和15929的11种血清多肽蛋白的浓度显著增高， m/z为2058、2146、2190 、2958、3163、5911和6116的7种血清多肽蛋白的浓度显著降低。极显著差异的多肽蛋白质结果见表1，极显著差异的多肽蛋白质指纹图谱见图1。表1 痰瘀证组与正常对照组之间差异多肽蛋白比较（略）

　　3 讨论
　　
　　蛋白质作为生命活动的“执行者”，参与了DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰、定位及信号传导等重要的生物过程。血浆或血清蛋白质组成与细胞、组织与器官的整个生理、病理以及机能状态密切相关，蕴藏着与疾病发生机制、早期诊断及预后评估密切相关的巨大信息［1］。蛋白质组学是从整体的角度，分析细胞内动态变化着的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间相互作用和联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律，其理论与技术特点，以及其整体、动态性的核心思想，与中医学的“整体观”和“辨证观”等理论体系有着惊人的类似之处，用此方法能揭示证候的物质基础并进行定量和定性分析。由此有学者［3］提出证候蛋白质组学观点，即在证候理论指导下，运用功能蛋白质组学的方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证的蛋白质差异表达及翻译后的修饰情况，提示与某一证候形成相关的所有蛋白质及特征，在整体蛋白质表达的水平上阐明证候本质。
　　
　　痰是机体水液代谢障碍所形成的病理产物。一般认为湿聚为水，积水成饮，饮凝成痰，总的来讲由于水湿痰饮均为津液在体内停滞而成。 “瘀，积血也。”（《说文解字》）故也称瘀血，是指体内血液停滞，不能正常循行，它既指积于体内的离经之血，又包括阻滞于血脉及脏腑内的运行不畅的血液。对痰与瘀的关系，历代医家认为：痰是津液的病理产物，瘀是血的病理产物，二者关系密切。

　　通过对14例痰瘀证患者进行SEL DITOFMS及蛋白质芯片技术检测，获得血清蛋白质指纹图谱，检测出1８种差异表达蛋白，其中m/z为5911的血清多肽蛋白浓度为14.48， 而正常对照组为30.90，痰瘀证患者明显降低，两者之间的Ｐ值为0.0003；m/z为3163的血清多肽蛋白浓度为4.23，而正常对照组为10.41，痰瘀证患者明显降低，两者之间的Ｐ值为0.00002。另一方面，m/z为6635 的血清多肽蛋白的浓度为26.64，而正常对照组为20.60，痰瘀证患者明显增高，两者之间的Ｐ值为0.008。此三种血清多肽蛋白可能为痰瘀证患者蛋白质指纹图谱主要表现特征，提示痰瘀证与正常健康人之间在血清蛋白质水平上存在差异，从实验客观指标上显示痰瘀证的发病机制及本质差异。

参考文献