PI3K/Akt抑制剂联合顺铂治疗肺癌的实验研究

　　　　　　作者：吴秋歌 王静 蒋军广 苗丽君

【摘要】 目的 探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2（4吗啉基）8苯基4氢1苯并吡喃4酮〕联合化疗药物顺铂（DDP）治疗肺癌的效应及可能机制，以期为肺癌的临床治疗提供新的理论依据。方法 培养肺腺癌A549细胞，采用MTT方法及流式细胞仪检测LY294002联合DDP对A549细胞增殖及凋亡的影响；通过裸鼠移植瘤实验检测LY294002联合DDP对A549细胞成瘤性的影响。结果 在一定剂量范围内，LY294002与DDP均可抑制A549细胞的生长，其抑制作用呈量效关系。LY294002与DDP联合作用可增强对A549细胞的抑制作用。LY294002与DDP均可有效的诱导A549细胞凋亡，联用后凋亡率显著增加。裸鼠移植瘤实验显示，LY294002与DDP均可抑制移植瘤的生长，联用后抑瘤率增加。结论 LY294002可增强DDP对A549细胞、裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用，该作用可能是通过增强对Ａ549细胞增殖的抑制以及诱导其凋亡来实现的。

【关键词】 肺肿瘤；凋亡；PI3K；LY294002；顺铂

细胞生存信号的转导对肺癌的发生发展起着至关重要的作用。PI3K/Akt信号转导通路在国外被视为癌细胞存活的首要通路。近年来对Akt的研究发现，Akt能够通过磷酸化其下游的多种作用底物促进对化疗和放疗的抵抗。PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2 (4吗琳基)8苯基4氢1苯并毗喃4酮〕可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔1，2〕。而LY294002对肺癌的研究还处于初始阶段，本研究旨在对PI3K/Akt的抑制剂LY294002与化疗药物顺铂（cisplatin，DDP）联用对肺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制进行探讨，为肺癌治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株与试剂 人肺腺癌细胞株Ａ549购自中科院上海细胞生物研究院；F12K培养基、LY294002及噻唑蓝(MTT)购自sigma公司；胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DDP（云南个旧生物药业有限公司，国药准字@53021740）；裸鼠由北京大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 细胞培养 A549细胞用F12K培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养。细胞为贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　1.3 MTT比色分析法 检测LY294002对A549细胞生长抑制作用。取对数生长期Ａ549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200 μl。于培养24 h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的DDP，DDP浓度依次为0.5、1、2、4、8、16 μg/ml，每组LY294002终浓度分别为20 μmol/L)，每组设6个复孔。于培养48 h后加入MTT(5 g/Ｌ)20 μl，继续培养4 h后吸出上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μl，振荡溶解10 min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长490 nm，空白孔调零，测定各孔吸光度Ａ。计算细胞生长的抑制率，抑制率=(1-实验组Ａ平均值/对照组Ａ平均值)×100%。

　　1.4 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化 取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为2×105/ml接种于培养瓶，加入上述不同浓度的药物（LY294002终浓度为20 μmol/L， DDP终浓度别为3 μg/ml），培养48 h后获取细胞，制成单细胞悬液， 4℃ 70%冷乙醇固定，放置4℃冰箱固定12 h以上。检测时，弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶1 ml（pH值 1.5～2.0）消化，采用碘化丙锭（PI）一步插入性DNA定量荧光染色法，上机检测细胞周期和细胞凋亡率。

　　1.5 裸鼠移植瘤模型的建立与干预 24只裸鼠，均为雌性，鼠龄为3～4 w，体重约18～20 g，实验和饲养均在无特定病原（SPF）条件下进行。随机将裸鼠分为4组：对照组、LY294002组、DDP组和LY294002+DDP组，每组6只，于裸鼠右上背部皮下接种对数生长期的A549细胞1×107/0.2 ml。待1 w后肿瘤长出。①LY294002组：给予LY294002 25 mg/kg，腹腔注射，每周2次；②对照组：等量生理盐水，腹腔注射；③DDP组：给予DDP 4 mg/kg，腹腔注射；④LY294002＋DDP组： LY294002 25 mg/kg＋DDP 4 mg/kg，腹腔注射；共3 w。裸鼠于最后注射药物2 d后处死，用药3 w。实验中注意观察裸鼠精神、进食、排便及体重情况，隔日测裸鼠体重及移植瘤直径。实验结束取出移植瘤，注意肿瘤转移情况，称重瘤结节，计算抑瘤率：抑瘤率（％）＝（对照组瘤结节重量-各实验组瘤结节重量）/对照组瘤结节重量×100％。取LY294002组及LY294002＋DDP组裸鼠肝、胃及肠做HE染色。

　　1.6 统计学方法 计量资料用x±s表示，用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析和Pearson相关分析，率的比较采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 LY294002联合DDP对A549细胞生长的抑制效应 MTT结果显示：LY294002浓度分别为5、10、20、40 μmol/L时，其抑制率分别为：26.94％、34.33％、42.53％、49.88％，可见在一定的浓度范围内，随着LY294002剂量的增加，其抑制率增加。根据LY294002对A549细胞的抑制效应选用LY294002浓度为20 μmol/L 作为与DDP联合的干预浓度。见表1。
　　
　　由表1可以看出：DDP单用时，浓度达1 μg/ml可显示抑制A549细胞的增殖，抑制率为11.41％，各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；随着浓度的增大，抑制作用增大，呈剂量效应关系（r＝0.808，P＜0.05）。LY294002与DDP联用时，DDP浓度为0.5 μg/ml即可显示出抑制A549细胞的增殖，抑制率为9.65％。各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。LY294002+DDP各浓度组与DDP单独作用对应各浓度组相比，DDP浓度为0.5 μg/ml和1 μg/ml时，抑制率的差异有统计学意义（P＜0.05）。当DDP浓度再增加，各药物联合组抑制率与DDP单用组相比，有增高的趋势，但其差异无统计学意义（P＞0.05)。低浓度组，药物联合组抑制率与DDP单用组相比，差别较大，DDP浓度越高，其差别越小。

　　2.2 LY294002与DDP联用对A549细胞周期及凋亡率的影响 DDP、LY294002及LY294002与DDP联用干预A549细胞后，各药物组凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）；DDP＋LY294002组与DDP组及LY294002组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。细胞周期分布与对照组相比都发生变化，表现为S期和G2/M期细胞减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。LY294002+DDP组细胞与DDP或LY294002单独作用于A549细胞相比，S期和G2/M期细胞减少（P＜0.05）。见表2。

　　2.3 LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的影响 裸鼠皮下接种A549细胞后，约1 w左右见皮下移植瘤出现，呈圆形或椭圆形结节。在实验过程中，各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。各组间裸鼠体重无明显差异（P＞0.05）。LY294002、DDP组、DDP+LY294002组瘤结节重量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。DDP+LY294002组瘤结节重量又低于LY294002、DDP组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。LY294002、DDP组、DDP+LY294002组的抑瘤率分别为40.3％、43.53％和67.46％，提示LY294002与DDP均能抑制裸鼠移植瘤的生长，两者联合应用抑瘤作用强于单独应用。见表3。

　　表1 LY294002与DDP联用对A549细胞生长的抑制效应（略）

　　与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与DDP单用组相比：3）P＜0.05

　　表2 LY294002联合DDP或紫杉醇对A549细胞周期的影响（略）

　　与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与DDP组相比：3）P＜0.05；与LY294002组相比：4）P＜0.05

　　表3 LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的抑制效应（略）

　　与对照组相比：1）P＜0.01；与LY294002组相比：2）P＜0.01；DDP组相比：3）P＜0.01

　　3 讨论
　　
　　非小细胞肺癌（NSCLC）约75％的肺癌患者在发现时已属晚期〔3〕，放、化疗对各期病人均为重要的治疗方法。而单纯采用化疗或放疗效果并不令人满意。研究证实DDP等化疗药物除直接杀伤肿瘤细胞外，还可诱导肿瘤细胞进入凋亡程序，由此推论，凋亡是耐药产生的共同途径〔4〕，细胞凋亡能力可直接影响化疗药物的效应〔5〕。肿瘤细胞可通过抑制进入凋亡程序，表现出对化疗药物的耐受性，是肿瘤细胞所具有的自我保护功能之一。选择性诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一条途径，有可能改善患者的预后〔6〕。P13K信号转导通路具有调节细胞的增殖、生存和分化等功能，PI3K可上调抗凋亡基因的表达，抑制由cmyc诱导的细胞凋亡〔7〕，以抑制细胞进入凋亡程序，促进细胞生存，因此推测P13K信号转导通路可能在多细胞耐药中发挥作用。最近肿瘤分子靶向治疗研究发现信号转导途径与肿瘤进展和放、化疗抵抗有密切的关系。PI3K/Akt抑制剂在体外可抑制多种肿瘤细胞的生长，导致肿瘤细胞凋亡〔8，9〕。近年的研究还发现PI3K/Akt抑制剂LY294002可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔2，10〕。
　　
　　本研究显示，DDP及LY294002对A549细胞的增殖有显著抑制作用，二者联用与单独干预相比对A549细胞增殖的抑制作用增强，说明LY294002有增加化疗药物治疗效果的趋势。DDP与LY294002均可影响细胞周期的分布，使细胞阻滞于G0/G1期，二者联用后，该作用增强。裸鼠移植瘤体内实验结果表明LY294002、DDP均能抑制裸鼠移植瘤的生长，LY294002与DDP联用时抑瘤率增加，说明LY294002能促进DDP的抑瘤效应。以上作用可能是通过以下3方面来实现的：①LY294002使细胞周期阻滞G0/G1期，抑制细胞的增殖；②LY294002促进细胞的凋亡；③有研究发现〔11〕若将P13K亚单位基因引入体外细胞系中，可使PI3K/Akt信号转导通路活性增强，细胞对化疗药物的敏感性会随之降低，耐药性增强。说明LY294002也可能通过增强对信号转导通路的调控增强肿瘤细胞对DDP的敏感性，从而使DDP的化疗效果增强。本研究过程中各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。实验结束后各处理组裸鼠体重亦无显著差异，解剖未见远处及局部淋巴结转移，各组肝、胃及肠道等重要脏器的HE染色未发现明显差异，说明LY294002在体内应用相对来说是安全的。但LY294002对人体是否有毒副作用及增加化疗药物的抗癌效果，由于细胞内及动物脏器的生理特点与人类有差别，还需要进一步的研究去证实。
　　
　　本研究认为，LY294002可促进Akt高表达肿瘤的抗肿瘤药物的疗效，而对于Akt低表达的肿瘤化疗效果无影响，其促进化疗疗效的作用主要是通过促进细胞凋亡实现的。而Howells等〔12〕在应用LY294002作用于乳腺癌细胞时，却发现其抑制癌细胞增殖与导致细胞凋亡并无直接关系。因此，LY294002本身抗肿瘤及与化疗的协同作用具体机制还不清楚，还存在许多悬而未决的问题，仍需进一步的更加精确的研究证实。

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