仙茅提取物体外抗氧化活性研究

　　　　　　 作者：张振东 吴兰芳 景永帅 杨娟

【摘要】 目的 探讨仙茅提取物的抗氧化活性。方法 先用80%乙醇，然后用蒸馏水对仙茅进行提取，其中醇提浸膏依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取；水提部分经醇沉，制备仙茅粗多糖。分别观察仙茅各提取物对羟基自由基 （·OH）、1，1二苯基2苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除率以及对Fe3+还原力。结果 与抗坏血酸比较，仙茅提取物对自由基均有较强清除作用，对·OH的清除率乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞粗多糖＞总醇提物，IC50值分别为0.247、0.358、0.796和0.871 mg/ml；对DPPH·的清除率乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>总醇萃取物>氯仿萃取物>石油醚萃取物>粗多糖，其IC50值分别为0.026、0.055、0.620、0.071、0.122和0.275 mg/ml。不同提取物对Fe3+有较强还原能力，还原力大小为：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>总醇提物>氯仿萃取物>石油醚萃取物>粗多糖。结论 仙茅具有明显的抗氧化活性，在抗衰老方面有广泛的应用前景。

【关键词】 仙茅；抗氧化能力；清除自由基；还原力

　　【Abstract】Objective To study on antioxidant activities of extracts from Curculigo orchioide in vitro. Methods Curculigo orchioides were treated with 80% ethanol and then the residue were extracted with water. The ethanol extract were extracted respectively using petroleum ether， chloroform， ethyl acetate， nbutanol. At the same time， crude polysaccharide was obtained by ethanol precipitation from water extract. Hydroxyl free radical（·OH）， DPPH free radical (DPPH·) and deoxidization Fe3+ reaction system were used to observe in vitro antioxidant effects of the above extracts. Results Compared with the ascorbic acid， the extracts had strong scavenging effect on free radicals， the activities sequence for scavenging ·OH were ethyl acetate extract> nbutanol extract> polysaccharide> ethanol total extract， which corresponding IC50 values were 0.247， 0.358， 0.796 and 0.871， respectively. The capabilities of scavenging DPPH were ethyl acetate extract> nbutanol extract> ethanol total extract> chloroform extract> petroleum ether extract> polysaccharide， and the corresponding IC50 values were 0.026， 0.055， 0.620， 0.071， 0.122 and 0.275 mg/ml， respectively. Different extracts had strong deoxidization ability of Fe3+， the activities sequence were ethyl acetate extract> nbutanol extract> ethanol total extract> chloroform extract> petroleum ether extract> polysaccharide. Conclusions Curculigo orchioides have stronger antioxidative activities and will be widely applicated on antiaging.
　　
　　【Key words】Curculigo orchioides; Antioxidant activity; Radical scavenging; Deoxidization

　　仙茅为仙茅科仙茅属植物仙茅(Curculigo orchioides Gaertn.)的干燥根茎，其性温，味苦，有小毒，用于肾阳不足、阳痿遗精、腰脊冷痛、尿频尿急、寒虚崩漏、带下、疮疡肿痛、痨虚内伤、筋骨疼痛等临床病症〔1〕。仙茅中含有皂苷类、酚类、木脂素类、黄酮类、桉烷类及甜味蛋白和多糖类成分〔2〕。现代药理研究发现，仙茅具有适应原样作用、抗炎、抗惊厥〔3〕、增强免疫功能〔4，5〕、抗衰老〔6〕、延缓生殖系统老化等生物活性〔2，7，8〕。为更好地开发利用仙茅药用资源，本实验运用体外抗氧化活性评价方法，对仙茅不同提取物抗氧化能力进行评价，为仙茅的进一步开发研究提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　仙茅购自贵州省贵阳市万东桥药材市场。二苯代苦味基肼自由基（DPPH·）购自百灵威公司；抗坏血酸（Vc）、无水乙醇、h3O2、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氟乙酸均为国产分析纯试剂，乙醇为食用级。

　　1.2 仪器与设备

　　HP8453型紫外可见分光光度计：惠普公司；JA2003精密电子天平：上海恒平科学仪器有限公司；DK9811电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。

　　1.3 样品的制备

　　仙茅干燥根0.9 kg，加80%乙醇回流提取6次，每次2 h，提取液减压浓缩至无醇味，水浴上蒸干，得仙茅总醇提浸膏184 g。取浸膏20 g，用适量水混悬，分别用两倍体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取6次，各萃取物经真空干燥得石油醚萃取物3 g，氯仿萃取物2 g，乙酸乙酯萃取物2 g，正丁醇萃取物4 g，避光贮存，备用。醇提仙茅残渣挥去乙醇后，加蒸馏水回流提取6次，每次2 h，合并水提液浓缩后，用乙醇沉淀多糖（乙醇终浓度不小于80%），沉淀依次用95%乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得仙茅粗多糖186 g。

　　1.4 抗氧化活性测定

　　1.4.1 清除羟基自由基（·OH）〔9〕

　　采用Fenton反应，利用h3O2与Fe2+混合产生·OH，在该体系中加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收。取醇提部分萃取物各50 mg，用无水乙醇定容至25 ml；取粗多糖50 mg，用蒸馏水定容至25 ml，配制成质量浓度为2 mg/ml，再以该质量浓度溶液配制成所需浓度。加入一定浓度样品4 ml，9 mmol/L FeSO4 0.5 ml，9 mmol/L水杨酸0.5 ml，8.8 mmol/L h3O2 0.5 ml，混匀，于37 ℃水浴中加热30 min，510 nm测定样品吸光度（Ai）。将体系中的样品改为加入4 ml蒸馏水，测定得空白对照吸光度（Ao），向体系中加入0.5 ml蒸馏水代替8.8 mmol/L h3O2，测定得样品本底吸光度（Aj），其中样品吸光度（Ai）每个质量浓度做3个平行，取平均值，以Vc作阳性对照，按下式计算清除率：K(%)=〔Ao-(Ai-Aj)〕/Ao×100。

　　1.4.2 清除DPPH·〔10〕

　　DPPH·是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517 nm处有较大吸收，当加入抗氧化剂一部分自由基被清除掉，使该波长下吸收强度减弱，可借此来评价某物质的抗氧化活性。取醇提部分萃取物各50 mg，分别用无水乙醇溶解并定容至25 ml；取粗多糖50 mg，蒸馏水定容至25 ml，配制成质量浓度为2 mg/ml样品，再以该质量浓度配制成所需浓度。以无水乙醇配制0.16 mmol/L DPPH·溶液，置于棕色容量瓶中。取3 ml样品溶液加入3 ml DPPH·溶液于25 ℃水浴中加热15 min后，在517 nm测得试样吸光度（Ai），取3 ml蒸馏水代替样品测得空白吸光度（Ao），以3 ml样品中加入3 ml蒸馏水测得样品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每个样品质量浓度做3个平行，取平均值。以Vc作阳性对照，按下式计算清除率：K(%)=〔Ao(Ai Aj)〕/Ao×100。

　　1.4.3 Fe3+还原力实验测定〔11〕

　　取2.5 ml不同质量浓度的样品溶液，加入0.2 mol/L，pH 6.6磷酸缓冲液2.5 ml及1% 铁氰化钾2.5 ml，50 ℃水浴反应20 min后急速冷却，加入10%三氟乙酸溶液2.5 ml混匀，0.2 μm水相滤膜过滤，取上清液5 ml，加入0.02% 三氯化铁溶液5 ml，10 min后立即于700 nm处测定吸光值。吸光值越大则还原能力越大，以Vc作为对照。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS 17.0统计分析软件，进行回归、Probit分析，选取可信度为95%，计算IC50。

　　2 结 果

　　2.1 对·OH的清除作用

　　各提取物对·OH都表现出一定程度的清除能力（图1），并在试验浓度范围内呈明显量效关系，但清除能力均弱于Vc。清除能力大小依次为：乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞粗多糖＞总醇提物，石油醚和氯仿萃取物由于样品本身干扰大，用该方法测定误差较大，未对其进行比较分析。从清除能力大小可以看出醇提部分抗氧化活性物质主要分布在乙酸乙酯和正丁醇萃取相中。考虑到样品本底吸收的影响，本试验样品最高浓度为1 mg/ml，未测定更高浓度样品的清除作用。仙茅提取物对·OH的半清除率浓度（IC50）大小顺序为：Vc ＜乙酸乙酯萃取物＜正丁醇萃取物＜粗多糖＜总醇提物，IC50值分别为0.062、0.247、0.358、0.796和0.871 mg/ml。IC50值越小表明清除能力越强，乙酸乙酯萃取物相对较好，但不如Vc的清除效果。

　　2.2 对DPPH·的清除作用

　　从图2可看出，各提取部分对DPPH·都表现出较强的清除能力，在试验浓度范围内呈量效关系。其中乙酸乙酯萃取物对DPPH·的清除能力最好，当质量浓度为0.05 mg/ml时清除率达到80%，只略差于Vc。清除能力大小依次为：Vc＞乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞总醇提物＞氯仿萃取物＞石油醚萃取物>粗多糖。可以看出在醇提部分，除乙酸乙酯提取物外，随着萃取用溶剂极性的增大，所得萃取物对DPPH·的清除能力越好；水提粗多糖清除能力相对最差，浓度为0.7 mg/ml时对DPPH·的清除能力仅为80%。仙茅提取物对DPPH·的IC50大小顺序为：Vc＜乙酸乙酯萃取物＜正丁醇萃取物＜总醇提物 ＜氯仿萃取物＜石油醚萃取物<粗多糖，IC50值分别为0.007、0.026、0.055、0.062、0.071、0.122和0.275 mg/ml。乙酸乙酯萃取物部分IC50远远小于其他各样品(P<0.01)，但是不如Vc 效果显著。
图2 清除DPPH·作用

　　2.3 Fe3+还原力的测定

　　还原力的测定，可检验化合物是否为良好的电子供应体，它所提供的电子可以使Fe3+还原为Fe2+，从而使体系溶液颜色改变，即反映出体系中氧化还原状态的改变。吸光值越大，还原力越强，抗氧化效果越佳。由图3可看出，在试验浓度范围内，各萃取物的还原力与其质量浓度成明显量效关系，各部分还原力大小依次为Vc＞乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞总醇提物＞氯仿萃取物＞石油醚萃取物＞粗多糖。从还原力测定的试验结果可知，在醇提部分，除乙酸乙酯提取物外，随着萃取用溶剂极性的增大，各萃取物对Fe3+还原力增强。粗多糖的还原力比醇溶性物质差。

　　3 讨论

　　在实验所选的3种体外抗氧化活性评价方法中，乙酸乙酯萃取物对·OH和DPPH·的清除以及对Fe3+还原力作用均显示出很好的效果，其次是正丁醇提取物，这可能与其化学成分主要是酚类及黄酮类大极性物质有关，据报道仙茅中的酚性成分具有抗氧化作用〔12，13〕。仙茅含有一定量的挥发油〔14〕，在本实验中，相对其他组分石油醚提取物抗氧化作用不明显，说明仙茅中挥发油成分抗氧化活性较弱。自由基理论认为衰老是氧自由基过度反应的结果，有机体的新陈代谢速率越高，氧自由基的产生就越快，衰老过程就加快，清除自由基可起到延年益寿的作用〔15〕。仙茅是一种补肾壮阳的常用中药，具有抗衰老作用〔6〕。本实验发现仙茅具有较强的体外抗氧化活性，为仙茅的抗衰老作用提供了科学依据。

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