血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡与乙酰胆碱含量变化

　　　　作者：张丽香 蔺心敬 李吕力 肖继东 王铁建 罗永坚

【摘要】 目的 探讨血管性痴呆（VD）大鼠海马神经元凋亡和乙酰胆碱(ACh)含量变化在VD发病过程中的作用。方法 将90只大鼠随机分为模型组、假手术组和正常组，每组30只。再将各组的30只大鼠根据造模后断头取脑时间随机分为3小组，即7、14、21 d组，每组10只大鼠。采用反复大鼠双侧颈动脉缺血再灌注，加剪尾放血法制备VD大鼠模型;用TUNEL法检测海马组织的凋亡细胞，用生化法检测ACh含量。结果 模型组大鼠海马组织在第7、14、21天均有大量凋亡神经元，且ACh含量持续降低，与假手术组及正常组相比差异显著（P＜0.01）。结论 脑海马组织神经元的大量凋亡和ACh含量持续降低可能在VD发病过程中起重要作用。

【关键词】 血管性痴呆；海马；神经元凋亡；乙酰胆碱

　　【Abstract】Objective To investigate the change of neuron apoptosis and acetylcholine in hippocampus of rat with vascular dementia (VD）. Methods 90 adult Wistar rats were randomly pided into model， shamoperation， control groups. Each group was randomly pided into three subgroups according to different time after being killed， including 7， 14 and 21 d after VD model. The imitative VD model was established by repeatedly clipping common carotid artery and bloodletting from rat′s tail. The cell apoptosis was tested with TUNEL technique， and the content of acetylcholine with immunohistochemistry in hippocampal. Results The apoptotic neuron of the hippocampal in the model group markedly increased and the acetylcholine decreased than those of the shamoperation and the control group at 7， 14， 21 days (P＜0.01). Conclusions The increase of the neuron apoptosis and the decrease of the acetylcholine in hippocampal tissues may be the pathological reason of the VD.

　　【Key words】Vascular dementia；Hippocampus；Apoptosis；Acetylcholine

　　近年研究表明〔1〕，在大于65岁的脑卒中患者中，约25%～41％的患者在三个月内发展为血管性痴呆（VD）。防治VD已成为目前急需解决的医疗和社会问题，但是目前对VD的发病机制尚不清楚。脑海马组织是与人类学习、记忆关系最为密切的功能区，具有对缺血的选择易损伤性〔2〕，其神经元凋亡可能在VD的发病过程中具有重要作用〔3〕。脑内乙酰胆碱（ACh）则是迄今发现的与人类学习、记忆关系最为密切的神经递质。有关神经元凋亡和ACh在VD大鼠脑组织中的动态变化及作用尚未见报道。本实验旨在通过对VD大鼠海马组织神经元凋亡和ACh含量的动态观察，探讨其在VD发病过程中的作用，以期为临床更好地预防VD的发生、发展提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂和仪器

　　凋亡TUNEL试剂盒购自美国ROSS公司，SABC、DAB 染色试剂盒、苏木素均购自武汉博士德生物工程有限公司。ACh由石家庄药业集团股份有限公司生产，UV3000紫外分光光度计由日本岛津公司生产，TD2000计算机图像分析系统由北京天地公司生产。

　　1.2 动物来源和分组

　　Wistar大鼠购自广西医科大学动物实验中心，雌雄各半，体重250～300 g，共90只。将90只大鼠造模后，根据断头取脑的不同时间随机分为3组，即造模后第7、14、21天断头取脑的大鼠分别为第1、2、3组，每组大鼠又随机分为3小组：①模型组、②假手术组、③对照组，每一小组有10只大鼠，各取5只分别用于脑海马组织神经元凋亡和ACh含量的检测。

　　1.3 VD模型制备

　　VD模型的制备参照蔺心敬等方法〔4〕。将大鼠用水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉，颈正中部常规消毒后切口分离双侧颈总动脉，套“4”号丝线扣，拉紧丝扣，阻断血流10 min后松开丝扣使血液灌注10 min，共重复3次，同时在距尾尖1 cm处剪断放血约1 ml后热凝止血。第3次再灌注后观察30 min后缝合皮肤，切口局部注射庆大霉素0.2万U，术后肌注青霉素0.2万U/d，连续3 d。假手术组大鼠仅分离双侧颈总动脉，对照组大鼠不做任何处理。

　　1.4 海马组织神经元凋亡检测

　　1.4.1 组织标本处理

　　实验终点将大鼠给予4%多聚甲醛灌注30 min。断头取脑放入4% 多聚甲醛固定后，依次酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。连续冠状切片，片厚5 μm。

　　1.4.2 TUNEL法检测细胞凋亡 按试剂盒说明进行。

　　1.4.3 结果观察

　　结果在40倍物镜下观察每张切片TUNEL阳性细胞，用TD2000计算机图像分析系统处理，采集图像输入计算机，以灰度计算所选视野阳性染色的单位面积（阳性细胞的面积占所选整个视野面积的百分比），每张切片取梗死灶边缘区互不重叠的5个视野，其均值即为该标本每个高倍镜视野中阳性细胞的单位面积。

　　1.5 海马组织ACh含量的检测

　　1.5.1 样本处理

　　实验终点将大鼠断头取脑，立即在冰盘上分离海马，称湿重后，将海马放入预冷的盛有0.9 ml 0.01 mol/L pH7.0 PBS和0.1 ml 1.5×10-3新斯的明的玻璃匀浆管中，冰浴中匀浆后离心（4 000 r/min，5 min），取上清液-60℃保存用于ACh含量的检测。

　　1.5.2 ACh含量测定

　　参考Kumage〔5〕和王平〔6〕的方法并加以改进。取上清液，加入等体积的三氯乙酸沉淀蛋白质后离心（1 500 r/min，15 min），取上清液再加入等体积的碱性羟胺、三氯化铁、1 mol/L HCl混匀后，用0.01 mol/L pH7.0的PBS稀释至3 ml，于540 nm处测其吸光值，平行法计算ACh含量。

　　1.6 统计学方法

　　结果以x±s表示，应用SPSS11.5软件中的独立样本t检验和方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠海马组织神经元凋亡情况

　　光镜下观察，TUNEL染色阳性凋亡神经元的细胞核呈棕黄色，神经元体积缩小，呈三角形或扇形，尼氏小体消失，核固缩深染，核内染色质浓聚，染色质浓集于核周，呈新月形、环形、长条形、块状小体甚至形成核碎片。而阴性神经元的胞核则不显示黄色，神经元形态正常故较易区别。正常组和假手术组大鼠海马组织中只有零星的凋亡神经元；而模型组大鼠可见大量凋亡神经元，呈大量成簇出现，14 d时凋亡神经元最多(见表1、图1)。表1 大鼠海马组织神经元凋亡情况(略)

　　2.2 大鼠海马组织中ACh含量的检测结果

　　在大鼠海马组织ACh含量的3次检测中，模型组大鼠和假手术组及正常组大鼠间均存在显著性差异（P＜0.05），假手术组和正常组大鼠检测结果间无显著性差异（P＞0.05）。同时，模型组大鼠的3次检测结果间均无显著性差异（P＞0.05）。表明模型组大鼠海马组织ACh含量持续降低。见表2。表2 大鼠海马组织ACh含量(略)

　　3 讨论

　　研究表明〔7〕，在脑卒中的病理过程中存在细胞凋亡这一病理机制，脑神经元特别是对缺血非常敏感的脑组织——海马组织对凋亡损伤极其敏感。本研究结果表明：模型组大鼠海马组织在造模后7 d即出现神经元凋亡，到第14天达高峰，至21 d仍有大量神经元凋亡。海马组织是与认知功能相关的重要脑区，是学习、记忆的高级中枢，它直接参与信息的贮存和处理〔8〕。由于海马组织神经元的存活数量直接影响到神经元突触的可塑性效应，从而影响海马对信息的处理和传递〔9〕。因此，海马组织神经元的大量凋亡丢失可能是患者脑卒中后发生VD的病理基础，是VD发病的重要机制之一。
　　
　　脑内ACh仅作为神经递质存在于胆碱能神经元的囊泡中，它是迄今发现的与学习、记忆关系最为密切的一种神经递质，一旦释出则在细胞间隙内被胆碱酯酶迅速水解，故脑组织内的ACh含量可作为胆碱能结构和功能的一项特异性指标。Meck等〔10〕研究表明，痴呆大鼠脑海马组织ACh的释放量明显降低，而且降低程度与其记忆功能的降低密切相关。Tayebati等〔11〕研究发现，抑制海马组织ACh的分解，即增加海马组织ACh的含量，有助于VD模型大鼠海马组织神经递质的传递，从而有利于模型大鼠学习能力的改善。本实验对VD大鼠造模后第7、14、21天海马组织中ACh含量进行了动态观察，发现模型组大鼠海马组织中ACh含量较假手术组及正常组大鼠均明显降低（P＜0.05），而模型组大鼠的3次检测结果间无显著性差异（P＞0.05）。结果与Bales等〔12〕对阿尔茨海默病大鼠模型脑海马组织内ACh含量的检测结果一致，表明VD大鼠海马组织中ACh含量持续降低。由于脑内ACh是与人类智能最为密切的神经递质，故推测海马ACh含量的持续降低，可能是VD发生、发展的重要原因之一。至于VD大鼠海马组织ACh含量降低的原因，推测可能与海马组织是对缺血缺氧最敏感的脑组织有关。因为短暂脑缺血，即可造成海马组织神经元的膜磷脂代谢障碍、自由基过量产生、兴奋性氨基酸大量释放、细胞内Ca2+超载等。上述因素综合作用即可启动海马组织神经元的凋亡程序，造成大量海马组织神经元凋亡，使海马组织ACh合成减少、含量降低。后者进而影响动物的学习、记忆功能，最终造成痴呆。因此，寻找有效方法对脑卒中患者进行早期干预、从分子水平调控海马组织神经元凋亡、最大限度保留脑卒中患者脑功能，可能是预防脑卒中后VD发病的最佳途径之一。

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　　5 Kumage Y，Matsui Y. Output tissue levels and synthesis of acetylcholine during and after transient forebrain ischemia in the rat〔J〕.J Neurochem，1991;56:116973.

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　　10 Meck WH，Williams CL，Cermak JM，et al.Developmental period of cholin sensitivity provide an ontogenetic mechanism for regulating memory capacity and agerelated dementia〔J〕.Front Integr Neurosci，2007;1:711.

　　11 Tayebati SK，Di Tullio MA，Amenta F，et al.Effect of treatment with the cholinesterase inhibitor rivastigmine on vesicular acetylcholine transporter and choline acetyltransferase in rat brain〔J〕.Clin Exp Hypertens，2004;26(4):36373.

　　12 Bales KR，Tzavara ET，Wu S，et al.Cholinergic dysfunction in a mouse model of Alzheimer disease is reversed by an antiA beta antibody〔J〕.J Clin Invest，2006;116(3):82532.