脂联素对人脐静脉内皮细胞CD55和CD59表达的影响

【摘要】 目的 观察脂联素对人脐静脉内皮细胞补体调节蛋白CD55和CD59表达的影响。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞；分为空白对照组、C反应蛋白（CRP）组和脂联素组，人脐静脉内皮细胞分别与50 μg/ml的CRP和25 μg/ml的脂联素共同孵育48 h，流式细胞仪检测CD55和CD59的表达。结果 CRP刺激后CD55平均荧光强度、CD59平均荧光强度和CD55阳性百分率较空白对照组升高（3.84±0.21比2.81±0.06，P＜0.001；69.72±4.48比51.15±7.86，P＜0.01；98.30±1.13比93.57±1.18，P＜0.001)；脂联素刺激后CD59平均荧光强度和CD55阳性百分率较空白对照组升高（63.02±4.90比51.15±7.86，P＜0.05；96.55±0.66比93.57±1.18，P＜0.01）。结论 脂联素是人脐静脉内皮细胞CD55和CD59表达的上调因素，并可能通过上调内皮细胞CD55和CD59的表达发挥抗炎、抗动脉粥样硬化作用。

【关键词】 脂联素；补体调节蛋白；动脉粥样硬化

脂联素是脂肪细胞分泌的特异性脂肪细胞因子，有调解糖脂代谢及抗动脉粥样硬化特性。C反应蛋白(CRP)可激活补体经典路径并有促动脉粥样硬化作用。近几年的研究发现高脂血症患者外周血淋巴细胞 CD55、CD59 表达下调〔1〕；CD55 阳性淋巴细胞平均荧光强度与腰围、腰臀比和 CRP 负相关〔2〕，与脂联素正相关〔3〕，这提示脂肪细胞因子和炎症状态很可能影响补体调节蛋白表达。本研究通过体外实验揭示 CRP 和脂联素对人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）补体调节蛋白表达的影响，探讨补体调节蛋白表达的调节机制及脂联素抗动脉粥样硬化的新机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　HUVECs购自中南大学湘雅细胞库；重组人脂联素球形结构域购自 Biovendor公司；CRP 购自 Chemicon公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；RPMI1640 购自 Gibco公司；胰酶购自Sigma公司；流式细胞仪为美国Coulter.EPICS.XL；PE标记的CD55单抗购自Ebioscience公司，批号为E025933；PE标记的CD59单抗购自Caltag公司，批号为1380842C。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　HUVECs培养于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每天换液一次，每2～3天用0.25%的胰酶消化传代。生长至85%融合时用0.25%胰酶消化、细胞计数板计数后均匀接种于24孔细胞培养板备用，接种细胞密度为5×104个/ml。

　　1.2.2 CRP对HUVECsCD55和CD59表达的影响

　　①实验分组：待细胞贴壁后改用含8%胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h后弃去培养液；按照随机化原则CRP组重复5孔，空白对照组重复5孔；根据预实验结果CRP组每孔加入浓度为50 μg/ml的CRP，用含5%胎牛血清的RPMI 1640调至相同体积；两组细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后进行流式细胞仪检测。②HUVECs CD55和CD59表达的检测：0.25%胰酶消化后吹打成均匀单细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃去上清；加入PBS液2 ml，1 500 r/min离心5 min，弃上清，如此洗涤2次；留取细胞沉淀加入1 ml PBS液吹打成均匀单细胞悬液；阴性对照管分别加入鼠抗人IgG1和鼠抗人IgG2a 10 μl及细胞悬液100 μl，标号的样品管分别加入PE标记的CD55单抗和CD59单抗各10 μl及细胞悬液100 μl；室温避光孵育15 min后用2 ml PBS重悬细胞；流式细胞仪分析5 000个细胞，SYSTEM ⅡTM软件分析。

　　1.2.3 脂联素对HUVECs CD55和CD59表达的影响

　　①实验分组：待细胞贴壁后改用含8%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养24 h后弃去培养液；按照随机化原则脂联素组重复5孔，空白对照组重复5孔；根据预实验结果脂联素组每孔加入浓度为25 μg/ml的脂联素，用含5%胎牛血清的RPMI 1640调至相同体积；两组细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后进行流式细胞仪检测。②HUVECs CD55和CD59表达的检测同上。

　　1.3 统计学处理

　　采用 SPSS13.0 软件，数据以x±s表示，组间比较用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 CRP对HUVECs CD55和CD59表达的影响

　　50 μg/ml的CRP孵育48 h后，HUVECs CD55百分率和空白对照组比较显著升高(P＜0.01)；CD59百分率和空白对照组比较统计学差异无显著性；CD55平均荧光强度与空白对照组比较显著升高(P＜0.01)；CD59平均荧光强度与空白对照组比较显著升高(P＜0.01)，见表1。

　　2.2 脂联素对HUVECs CD55和CD59表达的影响

　　25 μg/ml的脂联素孵育48 h后，HUVECs CD55百分率和空白对照组比较显著升高(P＜0.01)；CD59百分率和空白对照组比较统计学差异无显著性；CD55平均荧光强度与空白对照组比较统计学差异无显著性；CD59平均荧光强度与空白对照组比较显著升高(P＜0.05)，见表1。表1 CRP和脂联素对HUVEC表面CD55和CD59表达的影响(略)

　　3 讨论
　　
　　CRP是一种主要由肝细胞分泌的炎症标志物，通过在血管粥样硬化损伤处趋化单核细胞、诱导单核细胞产生组织因子、诱导内皮细胞产生黏附因子及刺激血管平滑肌增生和迁移等多种生物学作用加速动脉粥样硬化病灶进展；CRP也通过与C1q的结合激活经典补体活化路径，产生大量终末复合物造成血管内皮损伤。然而，与它的促炎作用相反，在体外实验中CRP显著上调HUVECs CD55和CD59表达强度及CD55表达百分率，这一上调作用减少了补体介导的内皮细胞溶解损伤〔4〕，提示CRP除了促炎特性外在炎症反应中也维持了血管完整性。CRP在血管壁上促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化的平衡也许对于动脉粥样硬化的发展有重要意义。CRP既可以激活补体系统，又通过上调补体调节蛋白表达抑制补体活化，表明CRP对补体活化具有双向调节作用。
　　
　　脂联素能促进脂肪酸β氧化和外周葡萄糖摄取及抑制肝糖异生，增加胰岛素敏感性；下调内皮细胞黏附分子表达；抑制巨噬细胞吞噬活性及A型清道夫受体表达；调控内皮细胞炎症反应。动物实验发现脂联素基因敲除小鼠动脉受损后内膜增生是野生型小鼠的2倍，补充脂联素后损伤血管新内膜的形成明显受到抑制〔5〕，这些表明脂联素有抗动脉粥样硬化的有益作用。近年研究发现高脂血症患者外周血CD55阳性淋巴细胞表达强度与腰围、腰臀比呈负相关〔2〕；腰围、腰臀比反映的是肥胖，肥胖的实质是脂肪细胞数量和/或体积的增加；脂联素是脂肪细胞分泌的细胞因子，肥胖患者中其血浆水平降低，并且高脂血症患者中脂联素血浆水平与外周血CD55阳性淋巴细胞表达强度呈正相关〔3〕，提示脂联素很可能影响了补体调节蛋白的表达。本研究从体外实验证实了脂联素刺激后，HUVECs CD59表达强度和CD55阳性百分率显著升高；CD55表达强度有上升趋势，但统计学差异无显著性，可能与CD55在细胞膜表面表达后脱落时间比CD59脱落时间早有关〔6〕。脂联素在体外直接上调HUVECs CD59和CD55表达表明脂联素是补体调节蛋白表达的一个上调因素。它是否能调节其他补体调节蛋白表达、其他脂肪细胞因子是否影响补体调节蛋白表达及通过哪条信号路径等问题仍有待于进一步深入研究。脂联素对内皮细胞CD55和CD59的上调保护了血管内皮免于补体活化介导的损伤，从而产生抗炎、抗动脉粥样硬化作用，这可能是脂联素多种已知抗动脉粥样硬化特性之外又一抗动脉粥样硬化的新机制。肥胖是动脉粥样硬化的危险因素之一，与动脉粥样硬化之间的具体联系仍未阐明，本研究也提示脂肪组织通过补体系统影响了动脉粥样硬化的发生和发展。

　　总之，补体参与了AS的发生和发展，补体调节蛋白可以抑制补体活化，脂联素对CD59表达强度和CD55阳性百分率的上调表明脂联素是CD59和CD55的直接上调因素，并且这一作用可能是脂联素抗炎、抗AS的新机制，这也提示在AS的治疗中脂联素可能成为一个新的干预措施。

参考文献

　　1 刘艳英，刘永铭，杨京港，等.高脂血症患者血清补体C3、C4、备解素和白细胞补体调节蛋白CD35、CD55、CD59 的表达〔J〕.中国循环杂志，2005；20(1)：1769.

　　2 刘永铭，何津春，杨京港，等.阿托伐他汀对高脂血症患者补体调节蛋白CD55、CD59 表达的影响〔J〕.中华心血管病杂志，2005；33:10759.

　　3 杨正芳，刘永铭，赵 丽，等.高脂血症中脂联素水平与CD55、CD59表达的关系研究〔J〕.中华内科杂志，2007；46：490.

　　4 ShuHong Li，Paul E.Richard D，et al.CReactive protein upregulates complementinhibitory factors in endothelial cells〔J〕.Circulation，2004；109:8336.

　　5 Kubota N，Terauchi Y，Yamauchi T，et al.Disruption of adiponectin causes insulin resistance and neointimal formation〔J〕.J Biol Chem，2002；227:258636.

　　6 Tsuji S，Kaji K，Nagasawa S.Decayaccelerating factor on human umbilical vein endothelial cells.Its histamineinduced expression and spontaneous rapid shedding from the cell surface〔J〕.J Immunol，1994；152:140410.