1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶致快速老化小鼠模型黑质纹状体系统的形态学改变

　　　　 作者：刘静 刘力 张忠霞 张宝华 周美刚 马琳 王铭维

【摘要】 目的 探讨1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）导致快速老化小鼠（SAMP8）黑质纹状体系统的形态学改变。方法 24只健康雄性12周龄SAMP8小鼠，随机分为盐水对照组和MPTP组，分别于第一次给药后6、24 h、3和8 d 4个时间点处死小鼠，每个时间点3只；背部皮下注射MPTP 20 mg/kg，每2 h一次，注射4次。用免疫组织化学染色技术检测各时间点黒质酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元形态及数量、纹状体TH免疫反应性及黑质区尼氏染色检测神经元状态。结果 MPTP组和对照组比较：黑质TH阳性神经元数目于第1次注射后6、24 h、3、8 d分别减少7.06%（P＞0.05），12.79%（P＜0.05），22.49%（P＜0.01），42.39%（P＜0.001），其中3 d和8 d比较有显著差异(P＜0.01)；纹状体TH免疫反应性（COD值）减低，6 h(P＜0.05)，24 h(P＜0.01)，3 d(P＜0.001)，8 d(P＜0.001)，其中24 h与3 d比较差异显著(P＜0.05)；尼氏染色可见对照组细胞多，形态完整，胞核饱满，核仁清晰，尼氏体丰富。MPTP注射后逐渐出现细胞胞核固缩，核仁模糊不清，胞体及胞核形态不规则，崩解，细胞稀疏，残存的细胞周围可见大量细胞碎片。结论 MPTP可导致SAMP8小鼠黑质多巴胺(DA)能神经元减少及纹状体DA能纤维丢失等帕金森样病理改变。

【关键词】 SAMP8小鼠；MPTP；帕金森病（PD）；病理形态学

　　【Abstract】 Objective To explore the morphologic change of nigra and striatum system of senescence accelerated mouse prone8 (SAMP8) induced by MPTP. Methods 24 SAMP8 mice of 12 weeks old were randomly pided into physiological saline control group and MPTP group. The mice were killed on 6， 24 h， 3， 8 d after the first given medicine respectively (n=3). MPTP was given by backside hypodermic injection on 20 mg·kg-1·2 h-1，and added up 4 times. Tyrosine (TH) positive cells in nigra TH immune reactivity in striatum were observed by immunohistochemistry and the morphologic changes of neurons in nigra were observed by Nissl′s staining. Results Compared with control group， the TH positive cells in nigra decreased by 7.06%（P=0.235），12.79%（P＜0.05），22.49%（P＜0.01），42.39%（P＜0.001）on 6，24 h，3，8 d after the first given medicine respectively， and there was obvious difference between the 3 and 8 days after the first given medicine (P＜0.01) in MPTP group. Compared with control group， TH immune reactivity in striatum decreased in MPTP group， and there was obvious difference between the 24 h and 3 days after the first given medicine (P＜0.05). In control group， Nissl′s positive cells was much more， had integrated morphology， full and clear nucleolus and full Nissl′s bodies. After given MPTP， there were karyopyknosis and ambiguous nucleolus， irregular sharp cell body and nucleolus， disintergration， and amount of cell debris. Conclusions MPTP can decrease the dopamine energy neurons in nigra and dopamine energy nerve fiber in striatum， induce the pathologic changes of Parkinson disease (PD)， which provide theory basis on the application of SAMP8 mice for the PD research.
　　
　　【Key words】 SAMP8 mice; MPTP; Parkinson disease; Morphology

　　目前研究者已开始关注老年动物在帕金森病(PD)的研究中应用〔1，2〕。但这些老年动物饲养周期长（如老年猴20年以上，C57BL/6小鼠12月龄以上）不易获得等因素制约了PD老年动物模型的研究发展。SAMP8小鼠为快速老化小鼠，是研究衰老及衰老相关性疾病的很好的动物模型〔3，4〕，但其多用于老年性痴呆的研究，是否可用于PD的研究尚需探讨。为此本研究观察MPTP导致SAMP8小鼠黑质纹状体系统的病理形态学改变，探讨其应用于PD研究的可行性。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组 选用12周龄、体重23～27 g雄性SAMP8小鼠24只(由香港中文大学解剖学系赠与)，随机分为对照组和MPTP组，各12只，每组再分别于第1次注射后6、24 h、3和8 d4个时间点处死小鼠，每个时间点3只；自由进食水，室温20～22℃，保持12 h照明、12 h黑暗的周期，适应环境1 w后进行实验。

　　1.2 给药方法 MPTP组小鼠背部每次皮下注射MPTP（Sigma，USA）20 mg/kg，连续注射4次，每次间隔2 h。对照组注射生理盐水。

　　1.3 样本取材 各时间点实验动物于腹腔内注射10%水合氯醛麻醉，经左心室依次灌入生理盐水30 ml，4%多聚甲醛液100 ml（0.5～1 h），立即取脑。所取脑标本置于4℃多聚甲醛溶液中，后固定24 h，进行常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。将小鼠脑组织分别于纹状体和中脑部分做连续冠状切片，片厚5 μm，每隔14张取1张，用于酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色。

　　1.4 ABC法免疫组织化学染色 将切片常规脱蜡至水，0.01 mol/L（pH6.0）枸橼酸缓冲液抗原修复，3%h3O2室温孵育40 min，10%正常羊血清37℃封闭1 h，加兔抗TH（1∶5 000 Chemicon）4℃过夜后37℃孵育1 h，随后依次加入1%生物素化二抗和辣根过氧化物酶标记三抗（北京中杉），均37℃孵育30 min，最后DAB（北京中杉）显色，自来水终止。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在孵育过程中用PBS溶液代替一抗做空白对照。

　　1.5 尼氏染色 标本取材同前。黑质区脑组织切片常规脱蜡至水，浸入0.25%硫堇溶液中室温8～10 min，80%～95%酒精脱色至适度，无水酒精脱水，二甲苯透明、中性树胶封片。

　　1.6 黑质多巴胺(DA)能神经元计数 每只小鼠中脑黑质区共取8～9张脑片（取片方法见上），显微镜下观察黑质TH阳性神经元表达，盲法由第三人于200倍视野下计数脑片上同一侧黑质区的TH阳性神经元数目，取均值。

　　1.7 纹状体TH免疫反应性 每只小鼠纹状体区取6张脑片（取片方法见上），应用NISElements imaging software(Nikon)测定纹状体区TH免疫阳性产物的光密度值（OD值），并减去同一张切片上的胼胝体的OD值作为实际OD （矫正光密度值 COD值），用COD值进行比较分析，取均值。

　　1.8 统计学处理 运用SPSS11.5统计软件进行Oneway ANOVA分析。

　　2 结果

　　2.1 黑质DA神经元TH免疫组织化学染色 对照组黑质内 TH 阳性神经元数量较多，胞体较大，呈锥体形或椭圆形，阳性物质为深棕黄色，位于胞浆，着色较均匀。MPTP组阳性细胞稀疏，胞体小，胞质较浓染，见图1。TH阳性神经元计数结果显示，对照组TH阳性神经元数目为181.4±10.453 0，MPTP组6 h为168.6±12.707 9、24 h为158.2±21.160 4、3 d为140.6±4.584 9、8 d为104.5±5.097 3 ；与对照组比较，MPTP组TH阳性神经元数目在以上各时间点分别减少7.06%（P＜0.05），12.79%（P＜0.05），22.49%（P＜0.01），42.39%（P＜0.001），其中6 h与24 h比较、24 h与3 d比较差异均不显著(P＞0.05)；3 d和8 d比较差异显著(P＜0.01)。神经元的丢失从6 h即有，但以3至8 d最为显著。

　　2.2 纹状体区TH免疫组织化学染色 纹状体区TH阳性产物呈棕黄色，对照组纹状体区TH阳性产物染色较深，均匀。MPTP组随时间延长纹状体区TH染色逐渐变浅淡，不均匀，于注射后第3天明显，第8天最为浅淡，见图1。其COD值结果显示，对照组为0.053 07±0.003 8，MPTP组6 h为0.042 67±0.006 8，24 h为0.041 58±0.002 0，3 d为0.030 8±0.001 6，8 d为0.026 56±0.004 2；与对照组比较MPTP注射后6 h即有COD值的显著减少(P＜0.05)，24 h(P＜0.01)，3 d(P＜0.001)，8 d(P＜0.001)；其中6 h与24 h，3 d与8 d的COD值比较均无显著性差异(P＞0.05)，但24 h与3 d有显著差异(P＜0.05)。纹状体TH阳性纤维的丢失从6 h即有，3 d最显著，8 d达到稳定。

　　图1 各组SAMP8小鼠黑质TH阳性神经元（×400）和纹状体TH免疫反应性（×100）的免疫组织化学染色（略）

　　2.3 黑质尼氏染色 与MPTP组相比，对照组黑质区神经细胞多，细胞形态完整，胞核饱满，核仁清晰，尼氏体丰富。MPTP注射后6 h可见神经细胞固缩，浓染；24 h至3 d核仁模糊不清，胞体及胞核形态不规则，神经元胞体崩解，8 d时残存细胞稀疏，胞体小，周围可见较多细胞碎片，见图2。图2 各组SAMP8小鼠黑质尼氏染色（×400）

　　3 讨论
　　
　　MPTP在小鼠身上引起的生化和细胞的改变与PD非常相似〔5〕，大部分用于阐明PD DA能神经元死亡根本机制的研究是在MPTP小鼠模型上完成的〔6〕。目前常用的小鼠PD模型为C57BL/6小鼠〔7〕。
　　
　　研究表明衰老是PD重要的危险因素〔8〕。因此应用老年动物研究PD的发病机制，必将大大推进人类对PD的深入了解，更好的治疗PD。SAMP8小鼠为快速老化小鼠，其平均寿命10～17个月，4～6个月成熟期后便迅速衰老，除具一般老化症状外，主要以学习记忆功能呈增龄性加速衰退为特点，此外在增龄过程中还可出现昼夜节律紊乱、情感障碍等改变〔9〕。PD除运动症状外，还有非运动症状（学习记忆、情感、情绪等）的改变，这在目前PD模型的动物中是不能满足的。因此如能将SAMP8小鼠应用到PD的研究中可能更具有独到之处。但小鼠的黑质纹状体通路对MPTP的神经毒性的敏感性依据种属的不同而不同〔10〕，为此，本研究旨在从形态学改变证实MPTP是否可导致SAMP8小鼠黑质纹状体系统的损害。
　　
　　TH是催化酪氨酸合成DA的限速酶，DA神经元中含量丰富，是脑内多巴胺能神经元的蛋白标志。因黑质区其他神经元缺乏TH，故TH免疫反应阳性神经元即DA神经元。黑质DA神经元纤维投射到纹状体区，故在该区可探测到TH阳性纤维，其阳性表达强弱可直接反映黑质纹状体纤维的数量。本研究发现纹状体DA能投射纤维的脱失先于黑质TH阳性神经元的减少，这与文献报道〔11〕一致。
　　
　　本研究证实12周龄SAMP8小鼠给与背部皮下注射MPTP 20 mg·kg-1·2 h-1注射4次，可导致其黑质纹状体系统的急性损伤，产生帕金森样的病理形态学改变，为SAMP8小鼠应用于PD的研究奠定了理论基础。

参考文献

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　　7 姚庆和，高国栋.MPTP的毒性机制与帕金森病动物模型〔J〕.国外医学·神经病学神经外科学分册，2004;31（1）:458.

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